第五章液相色谱第12节

1、第五章 高效液相色谱法n在农药制剂分析中，高效液相色谱法发展很快，除了氨基甲酸酯类农药外，热稳定性差的和分析前需要进行衍生化处理，才能使用气相色谱法的农药，都可使用此法。n与农药残留分析不同，使用高效液相色谱法分析农药制剂的特点是样本处理比较简便，液体样本通常稀释后即可进样，固体农药制剂则需用适当的溶剂提取，过滤后即可进样。n如果需要净化和浓缩，可以使用塑料20.5cm指形层析柱来净化和提取农药。n在我国已商品化的指形层析柱有硅胶和弗罗里硅土柱，用来分离和提取溶于石油醚类溶剂中的稍带极性的农药，还有C18小柱，可以分离、提取水和甲醇中的农药。n农药常量分析和残留分析的区别的:n残留分析要求灵敏

2、度高和能检出其类似结构的有毒代谢物，但准确度要求不高;n常量分析时样品中有效成分含量较高，对方法的灵敏度要求不高，但方法的准确度和精密度必须达到要求，而且要求样本负载量在较大范围内都有响应。因此在用液相色谱法测定农药时，必须具有以下最基本的设备：一个带有梯度洗脱的泵系统、可变波长的紫外检测器、柱加热器和定量进样环装置。可连续改变波长的紫外检测器是很有用的，如带有停留扫描装置可以选择最大吸收波长，测定时可根据需要选择合适的色谱柱和流动相以达到最好分离。(一)分离类型的选择n在进行液相色谱分析前。n首先要仔细研究农药的特性及该项分离分析的目的，以选择最合适的方法、任何一种分离类型都不是万能的，它们

3、各适用于一定的分离对象，可根据农药的分子量、极性、溶解度、分子结构、解离情况等特性。n选择分离类型，参见图514。n农药的分子量一般小于2000，在选择高效液相色谱的分离类型时，首先要了解农药的溶解度，将它们分为溶于水的和不溶于水而溶于有机溶剂两类。n不溶于水、溶于有机溶剂的非极性农药，可以使用液固吸附色谱，n菊酯类农药如溴氰菊酯、氯氰菊酯都可使用液固吸附色谱，尤其是对各异构体的分离，如氯氰菊酯的测定是使用5m的硅胶柱，以0.5 vv乙酸乙酯异辛烷作为移动相，柱温50，以苯甲酸甲酯为内标，各异构体和内标均得到很好地分离，在注温为50土20时，其出峰时间见图515。n此外如辛硫磷、氯辛硫磷均可使

4、用液固吸附色谱，n前者以(96十4) vv正己烷十四氢呋喃为流动相，后者以(95十5) vv正己烷十乙酸乙酯为流动相，在5m的硅胶柱上可使有效成分与杂质分离，在早期对硫磷、甲基对硫磷、克百威、异丙威等农药都可使用液固吸附色谱分离和分析。n 从图515可见，不溶于水的、极性或非极性农药均可使用反相液液色谱法，由于液固 吸附色谱重复性差，要使用价格较贵的正己烷和异辛烷等有机溶剂。n现在普通选用反相键合相色谱，事实证明许多农药都可使用C18反相键合相色谱，这类色谱分离时使用乙腈或甲醇和水为流动相，我国都使用甲醇，价格低廉易得；n近年CIPAC推荐的方法如乐果、磷胺、久效磷灭害威、残杀威、克百威以及三

5、氯杀螨醇等都是使用反相键合相色谱，如在三氯杀螨醇原药分析中，使用C8 (Zorbax) 6m 2504.6(id)mm不锈钢柱，以甲醇 水 乙酸75 25 0.2(vv)为流动相，紫外吸收波长为254nm，柱温30时，o，p与p，p三氯杀螨醇可以分开，DDT各异构体和代谢物亦可分开，见图516。n又如我国辛硫磷乳油的国家标准(GB 955788)是采用反相键合相色谱，柱填充物为全多孔型硅胶硅烷化键合相(C18)样品用甲醇溶解，使用定量进样阀将样品溶液注入色谱系统，用254nm紫外检测器检测，采用外标法计算辛硫磷含量。n 以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相色谱法。n最早的液

6、相色谱法是用菊根粉的吸附柱来分离植物的提取物，用石油醚淋洗，植物提取物中的成分以不同速度向下移动，分离成许多颜色带排列在柱上，这些黄色、绿色的色柱称为色层谱。n后来，不仅用于有色物质，也可用于分离无色物质，这种借助于移动速度不同而达到分离和鉴定的技术随着生产和研究的需要不断地发展。 经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内，吸附剂粒径大于l00m，柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高，每根柱只能使用1次；流动相由柱管上端依靠重力向下流过柱子，分离速度慢；各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进行测定，效率很低，分析速度很慢。 40年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快

7、，但重复性差，难以进行定量测定。直到60年代初吉丁斯(J.C.Giddings)将气相色谱理论修正后用于液相色谱，为其现代化奠定了理论基础。以后在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化；这种色谱技术称为高效液相色谱法。和经典柱色谱法相比，具有以下特点：n 1高压 流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地通过色谱柱，必须施加高压。一般可达150一300 kgcm2。n 2高速 使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为110 m1min，使样本的分离速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟。n 3高效 使用颗粒均匀的新型细粒固定相

8、，提高了分离效率，一般注效可达50000塔板m以上，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。n 4高灵敏度 应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外检测器，最小检测量可达l109g。n 5高度自动化 利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化。n 6流出组分容易收集 高效液相色谱法和气相色谱法都是重要的分离分析方法，它们在许多方面是相同和相似的，但也存在着差异。它们的应用领域不同。n在已知的化合物中，只有20可用气相色谱测定，而液相色谱法可检测的对象占有机物总数的80一85；气相色谱法局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析；高效液相色谱可分离和分折不挥发的，热稳定性

9、差的以及离子型的农药，而且样本前处理简便。n70年代至80年代初期、农药分析大多采用气相色谱法，因为气相色谱法对样本分离快、灵敏和方便，且大多数实验室已完善地配备了气相色谱仪和操作人员。n目前液相色谱技术迅速发展，它不受样品挥发性和热稳定的限制，绝大多数农药都可以使用液相色谱法进行定量分析，而且液相色谱技术在分析中的主要障碍检测器的灵敏度，在农药常量分析中是不重要的，因为农药制剂中有效成分含量通常是百分之几。多数农药分子结构中有吸收紫外光的基因，对那些难于用气相色谱测定的农药，可以简便地使用带有紫外检测器的液相色谱法。测定样本时，使用定量的进样环和自动进样器，其精密度可以达到使用内标的气相色谱

10、法。 国际农药分析协作委员会(CIPAC)出版发行的CIPAC农药分析手册共有I、IA、IB、IC和D五卷。1985年出版的IC卷和气相色谱法约26个，液相色谱法约有20个；1988年出版的D卷中36个农药原药和制剂的有效成分含量分析方法中，气相色谱法有16个，液相色谱法有17个；1989年5月CIPAC第33届年会上讨论通过10个农药分析方法，其中就有乐果、磷胺、久效磷、保棉磷、碘苯腈和大隆等6个农药采用液相色谱法。 从以上统计数字看：日前液相色谱法在农药分析中已和气相色谱法的数量相当，通常使用一种方法测定后，可以用另一种方法来签定，两种方法在常量分析中可以具有相同的准确度和精密度。 随着液

11、相色谱技术的发展和普及，更多的农药将会使用液相色谱法进行分析。 此外，高效液相色谱法和气相色谱法使用的流动相不同，亦存在以下差别： (1)气相色谱法的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的流动相通常是惰性气体，由检测器的类型来决定，不论使用氢气、氦气或氮气，其作用只是运载样本组分通过色谱柱后进入检测器，而对色谱分离的影响一般很小，即仅有固定相对样本分子中各组分的选择性，因此气相色谱主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。n而液相色谱的流动相为液体，它对样本具有一定溶解性能，除了运载样本组分通过色谱柱和进入检测器外，还参与色谱分离过程；n在液相色谱中除通过改变固定相改善分离效果外，通常用改变流动相组成来改善分离，流动相组成可以灵活改变，使用的流动相不同可得到完全不同的分离。n(2)液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子。n根据这一原理的制备色谱，可用于制备农药标准品。n(3)农药分子在液体中的扩散系数比在气体中小45个数量级，所以在高效液相色谱中必须特别注