第四章荧光分析法第一节概述

1、第四章第四章 荧光分析法荧光分析法第一节第一节 概述概述一定义和分类一定义和分类 （1）定义：物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态）定义：物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光，根据物的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光，根据物质的光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法质的光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法称为荧光分析法称为荧光分析法 （2）分类）分类 1原子荧光分析法原子荧光分析法 2分子荧光分析法分子荧光分析法 优点：测定灵敏度高、选择性好优点：测定灵敏度高、选择性好 如紫外如紫外-可见分光光度法

2、可见分光光度法 10-7g/ml, 荧光分析法荧光分析法 10-1010-12g/ml第一节第一节 基本原理基本原理一分子荧光过程一分子荧光过程CAB基态激发单线态 激发三线态能量 * * * 基态电子光能量能量较高态激发单线态：电子自旋方向相反激发三线态：电子自旋方向相同能量稍低激发态分子不稳定通过辐射跃迁，无辐射跃迁等内活化过程释放能量基态释放能量过程1 振动弛豫2 内部能量转换3 荧光发射4 磷光发射5 外部能量转换不论分子处于哪一激发单线态内转换激发态最低振动能级辐射发出光量子基态任何振动能级荧光荧光能量激发能量，荧光波长激发波长荧光能量激发能量，荧光波长激发波长 二分子结构与荧光关系

3、二分子结构与荧光关系 （一）荧光寿命、荧光效率（一）荧光寿命、荧光效率 1荧光寿命荧光寿命f ：除去激发光源，分子荧光强度是激发荧光：除去激发光源，分子荧光强度是激发荧光 强度强度1/e所需时间所需时间分子激发态分子基态荧光强度呈指数衰减Ft = Foe-ktFo-激发时t = 0荧光强度Ft-激发后t时间的荧光强度k-衰减常 数设时 间t = fFt = (1/e)Fo(1/e)Fo = Fo e-k f1/e =k f = 1-k fek =1 fFt = Foe-kt或 lnFoFt=t f以 lnFoFt对时间t作图斜率1计算荧光寿命 f2.2.荧光效率荧光效率 j jf j jf =

4、激发态发射荧光光子数基态吸收激发光光子数如无其他去活化过程，荧光效率如无其他去活化过程，荧光效率 j jf =1，事实上，事实上j jf 1。如荧光素钠在水中如荧光素钠在水中j jf = 0.92, 荧光素在水中荧光素在水中j jf = 0.65。 （二）分子结构与荧光的关系（二）分子结构与荧光的关系发射荧光的两个条件：发射荧光的两个条件： 1强的紫外强的紫外-可见光吸收可见光吸收2一定的荧光效率一定的荧光效率 *n *分子结构：或紫外-可见光吸收实际上，n *跃迁几率小，弱吸收，荧光弱有荧光 *长共轭结构，强的紫外吸收，荧光强刚体平面结构，荧光效率高1.1.长共轭结构长共轭结构 共轭程度越高

5、，荧光效率越大，荧光波长长移共轭程度越高，荧光效率越大，荧光波长长移 ex205nm em278nmj jf0.11286nm321nm0.29356nm404nm0.36除芳香烃外，长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，如维生素除芳香烃外，长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，如维生素A CH2OCOCH3VA ex =327nm em =510nm 2分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性同样的长共轭分子，刚性和共平面性越大，同样的长共轭分子，刚性和共平面性越大，j jf ，荧光波长，荧光波长长移长移联苯j jf CH2j jf 芴两苯环之间为CH2, 不能自由旋转 电子共平面j jf，原来共平面性

6、好，分子中加入较大基团后，由于位阻原因，原来共平面性好，分子中加入较大基团后，由于位阻原因，共平面性共平面性，荧光减弱，荧光减弱SO3NaNCH3CH3SO3Na NH3CCH31-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐j jf = 0.75j jf = 0.03分子扭转，两环不共平面荧光减弱 3取代基取代基分子上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响，取代基分子上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响，取代基分为三类：分为三类： （1）增加分子的）增加分子的电子共轭程度，荧光效率电子共轭程度，荧光效率，荧光波，荧光波长长移，如长长移，如-NH2, -OH, -OCH3, -NHR,

7、 -NR2, -CN。 （2）减弱）减弱电子共轭程度，荧光电子共轭程度，荧光。如。如-COOH, -NO2, -C=O, -NO, -SH, -NHCOCH3 -。 （3）对）对电子共轭体系作用较小，如电子共轭体系作用较小，如-R, -SO3H, -NH3+。三三. 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 1温度温度 温度温度，运动速度，运动速度，分子间碰撞几率增加，无，分子间碰撞几率增加，无 辐射跃迁辐射跃迁，荧光强度，荧光效率，荧光强度，荧光效率。 2溶剂溶剂 一般情况下，溶剂极性一般情况下，溶剂极性，荧光强度，荧光强度，荧光波，荧光波 长长移。长长移。NH3+OH-H+NH2NH-

8、OH-H+pH 2pH712pH13 3pH值影响值影响 荧光分子是弱酸、弱碱时，弱酸、弱碱和离荧光分子是弱酸、弱碱时，弱酸、弱碱和离 子结构不同，不同酸度中分子和离子间的平衡改变，荧光子结构不同，不同酸度中分子和离子间的平衡改变，荧光 强度有差异。强度有差异。-NH2提高荧光强度，苯胺分子有荧光，提高荧光强度，苯胺分子有荧光，pH2或或pH13溶液中，离子形式存在，不能发射荧光溶液中，离子形式存在，不能发射荧光。 4荧光熄灭剂荧光熄灭剂 当在荧光物质分子溶液中，加入卤素离子、当在荧光物质分子溶液中，加入卤素离子、 重金属离子、氧分子及硝基化合物，荧光强度减弱。重金属离子、氧分子及硝基化合物，

9、荧光强度减弱。 5散射光干扰散射光干扰 （1）瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能）瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，仅是光子运动方向发生改变，对荧光强度有一定的量交换，仅是光子运动方向发生改变，对荧光强度有一定的干扰。干扰。 （2）拉曼光：光子与物质分子发生非弹性碰撞，光子把）拉曼光：光子与物质分子发生非弹性碰撞，光子把能量传给物质分子或从物质分子获得能量，发射出比入射光能量传给物质分子或从物质分子获得能量，发射出比入射光波长稍长或稍短的光，对荧光强度干扰很大。波长稍长或稍短的光，对荧光强度干扰很大。第三节第三节 定量定性分析方法定量定性分析方法 一荧光强度与物质浓

10、度的关系一荧光强度与物质浓度的关系IoIF荧光强度正比于荧光物质吸收的荧光强度正比于荧光物质吸收的光强度，光强度，F(Io I)F = K(Io I) I = Io10-ECL K为常数，取决于荧光效率，为常数，取决于荧光效率， Io-入射光强度，入射光强度，I-透射光强透射光强度，度，C-溶液浓度，溶液浓度，L-液层厚液层厚度度, E-物质吸光系数物质吸光系数F = K Io(1- 10-ECL)=K Io(1 - e-2.3ECL)=K Io1 - (1 +(-2.3ECL)1!+(-2.3ECL)22!+ -)=K Io 2.3ECL -(-2.3ECL)22!-(-2.3ECL)33!

11、-当浓度当浓度C很小，很小，ECL也很小，也很小，ECL0.05, 上式中第二项上式中第二项后可以忽略，后可以忽略，F = 2.3KIoECL = KC，在低浓度时，荧光，在低浓度时，荧光强度与溶液中荧光物质浓度呈线性关系。强度与溶液中荧光物质浓度呈线性关系。 ECL0.05，荧光强度与溶液中荧光物质浓度不呈线性，荧光强度与溶液中荧光物质浓度不呈线性关系。关系。二定量分析方法二定量分析方法FxCxCF1标准曲线法标准曲线法 已知量的标准物质和试已知量的标准物质和试样相同的处理之后，配制一系列标准溶样相同的处理之后，配制一系列标准溶液，测定这些溶液的荧光强度，以荧光液，测定这些溶液的荧光强度，以

12、荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，相同条件下测试样荧光绘制标准曲线，相同条件下测试样荧光强度，由标准曲线求出荧光物质含量。强度，由标准曲线求出荧光物质含量。 2比例法比例法 标准曲线过原点，在其线性范围内，可由比例标准曲线过原点，在其线性范围内，可由比例 法测定法测定Fs - Fo = KCsFx - Fo = KCxCx =Fx - FoFs - FoCsCFCxFxFsCs取已知量的对照品，配制成标准溶液取已知量的对照品，配制成标准溶液（Cs），测荧光强度（），测荧光强度（Fs），相同条），相同条件下，测试样荧光强度（件下，测试样荧光强度（ Fx），按比），按比例关系计算试样中荧光物质含量例关系计算试样中荧光物质含量Cx。 Fo为空白溶液的荧光强度为空白溶液的荧光强度 3多组分混合物荧光分析多组分混合物荧光分析 (nm)ab 1 2F混合物各组分荧光峰相距较远，混合物