综合化学实验化学生物学实验一四 ppt课件

1、综合化学实验综合化学实验- -化学生物化学生物学实验一、四学实验一、四多酚氧化酶的粗提、蛋白质含量、催多酚氧化酶的粗提、蛋白质含量、催化活性测定及电泳分析化活性测定及电泳分析 一、实验目的一、实验目的 在化学生物学研讨中，蛋白质及酶是其重要的在化学生物学研讨中，蛋白质及酶是其重要的研讨目的，特别是设计合成酶的抑制剂或激活研讨目的，特别是设计合成酶的抑制剂或激活剂，活性测定一定需求纯的酶制剂。剂，活性测定一定需求纯的酶制剂。 另外在化学遗传学或化学蛋白质组学研讨中，另外在化学遗传学或化学蛋白质组学研讨中，当发现某一种小分子化合物在细胞生化途径中当发现某一种小分子化合物在细胞生化途径中起作用后，也

2、需求将可以与小分子化合物结合起作用后，也需求将可以与小分子化合物结合的蛋白质分别提取出来，再经过多种方法进展的蛋白质分别提取出来，再经过多种方法进展鉴定。鉴定。 所以，蛋白质和酶的分别纯化及电泳分析等是所以，蛋白质和酶的分别纯化及电泳分析等是化学生物学研讨中一个极其重要的技术。化学生物学研讨中一个极其重要的技术。 本实验选取马铃薯、番薯、蘑菇、茄子为实验本实验选取马铃薯、番薯、蘑菇、茄子为实验资料，经过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、资料，经过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀等步骤获得多酚氧化酶的粗酶液，硫酸铵沉淀等步骤获得多酚氧化酶的粗酶液，对粗酶催化邻苯二酚、对粗酶催化邻苯二酚、L-

3、L-多巴的活性以及同工多巴的活性以及同工酶、分子量等进展测试。酶、分子量等进展测试。 经过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分经过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分别的根本原理和方法，掌握蛋白质含量测定方别的根本原理和方法，掌握蛋白质含量测定方法、多酚氧化酶活性的测定方法，电泳技术测法、多酚氧化酶活性的测定方法，电泳技术测定同工酶和分子量的方法，掌握相关仪器设备定同工酶和分子量的方法，掌握相关仪器设备的操作运用。的操作运用。 所提取的粗酶样品可作为实验三、实验四、实所提取的粗酶样品可作为实验三、实验四、实验五、实验六的资料。验五、实验六的资料。 一多酚氧化酶一多酚氧化酶 多酚氧化酶多酚氧化酶

4、(polyphenoloxidase(polyphenoloxidase，PPOPPO，EC.1.10.3.1)EC.1.10.3.1)是是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。它早在植物体内普遍存在的一类铜结合酶。它早在18951895年就被年就被发现，直至发现，直至19371937年才被分别得到。随着研讨的深化，它年才被分别得到。随着研讨的深化，它被分为单酚单氧化酶被分为单酚单氧化酶( (酪氨酸酶，酪氨酸酶，EC.1.14.18.1)EC.1.14.18.1)、双酚、双酚氧化酶氧化酶( (儿茶酚氧化酶，儿茶酚氧化酶，EC.1.10.3.2)EC.1.10.3.2)和漆酶和漆酶(EC.1. (EC

5、.1. 10.3.1)10.3.1)。如今所说的多酚氧化酶普通是儿茶酚氧化酶和。如今所说的多酚氧化酶普通是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。漆酶的统称。 PPOPPO通常是一种由通常是一种由4 4个亚基组成的寡聚蛋白质，如薯蓣皂个亚基组成的寡聚蛋白质，如薯蓣皂小球茎小球茎PPOPPO和莴苣的和莴苣的PPOPPO；但大白菜、香草中；但大白菜、香草中PPOPPO那么是由那么是由3 3个亚基聚合构成；蘑菇的儿茶酚氧化酶那么是一种多聚个亚基聚合构成；蘑菇的儿茶酚氧化酶那么是一种多聚酶，分重链酶，分重链(43 kD)(43 kD)和轻链和轻链(13.4 kD)(13.4 kD)。香蕉果肉中的。香蕉果肉中的PPO

6、PPO却是单体酶。不同种植物、同一植物体的不同部位及同却是单体酶。不同种植物、同一植物体的不同部位及同一部位的一部位的PPOPPO多基因家族的不同成员的分子量不同。多基因家族的不同成员的分子量不同。PPOPPO前体约前体约60-71 kD60-71 kD，成熟，成熟PPOPPO约约40-68 kD40-68 kD。 比较知的十几种植物，有菠菜、梨、桃、蚕豆、胡萝卜、比较知的十几种植物，有菠菜、梨、桃、蚕豆、胡萝卜、马铃薯、番茄、葡萄和苹果，发现它们的马铃薯、番茄、葡萄和苹果，发现它们的PPOPPO具有高度具有高度的类似性的类似性(45%-95%)(45%-95%)。整个氨基酸序列中，。整个氨基

7、酸序列中，N-N-导肽与导肽与C-C-端保守性较低，而端保守性较低，而CuACuA与与CuBCuB很保守很保守. PPO. PPO由多个基因编由多个基因编码，表现出多基因家族性，少那么码，表现出多基因家族性，少那么2 2或或3 3个，多那么个，多那么6 6或或7 7个基因。但有的植物，如葡萄只需个基因。但有的植物，如葡萄只需1 1个个PPOPPO基因。基因。 多酚氧化酶与植物组织培育的酶促褐变以及果蔬质量亲多酚氧化酶与植物组织培育的酶促褐变以及果蔬质量亲密相关。因此，研讨多酚氧化酶酪氨酸酶的抑制，密相关。因此，研讨多酚氧化酶酪氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化装品中的皮肤增白，以及对防止

8、水果、蔬菜的褐变，化装品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病黄褐斑等色素因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病黄褐斑等色素冷静性皮肤病等，具有非常重要的治疗意义。由此，冷静性皮肤病等，具有非常重要的治疗意义。由此，人们利用酪氨酸酶在生物和化学的催化特性以及相对应人们利用酪氨酸酶在生物和化学的催化特性以及相对应的酪氨酸酶抑制剂，开发了它在食品、美容、环境、医的酪氨酸酶抑制剂，开发了它在食品、美容、环境、医药和化学上的运用。药和化学上的运用。二考马斯亮兰法二考马斯亮兰法BradfordBradford法法测定蛋白质含量测定蛋白质含量 双缩脲法双缩脲法BiuretBiuret法和法和Fo

9、linFolin酚试剂法酚试剂法LowryLowry法的明法的明显缺陷和许多限制，促使科学家们去寻觅更好的蛋白质溶液显缺陷和许多限制，促使科学家们去寻觅更好的蛋白质溶液测定的方法。测定的方法。 19761976年由年由BradfordBradford建立的考马斯亮兰法建立的考马斯亮兰法BradfordBradford法，是法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超越其他几种方法的突出优点，因此正在得到广泛的运具有超越其他几种方法的突出优点，因此正在得到广泛的运用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。用。这一方法是目前

10、灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由料的最大吸收峰的位置，由465nm465nm变为变为595nm595nm，溶液的颜色也，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研讨以为，染料主要是与蛋白质中的由棕黑色变为兰色。经研讨以为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。在在595nm595nm下测定的吸光度值下测定的吸光度值A595A595，与蛋白质浓度成正比。，与蛋白质浓度成正比。BradfordBr

11、adford法的突出优点法的突出优点 1 1灵敏度高，据估计比灵敏度高，据估计比LowryLowry法约高四倍，其最低蛋白法约高四倍，其最低蛋白质检丈量可达质检丈量可达1mg1mg。这是由于蛋白质与染料结合后产生的。这是由于蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因此光吸收值随蛋白质浓度的变化比因此光吸收值随蛋白质浓度的变化比LowryLowry法要大的多。法要大的多。 2 2测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需求的测定，只需求5 5分钟左右。由于染料

12、与蛋白质结合的过分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只需程，大约只需2 2分钟即可完成，其颜色可以在分钟即可完成，其颜色可以在1 1小时内坚持小时内坚持稳定，且在稳定，且在5 5分钟至分钟至2020分钟之间，颜色的稳定性最好。因分钟之间，颜色的稳定性最好。因此完全不用像此完全不用像LowryLowry法那样费时和严厉地控制时间。法那样费时和严厉地控制时间。 3 3干扰物质少。如干扰干扰物质少。如干扰LowryLowry法的法的K+K+、Na+Na+、Mg2+Mg2+离子、离子、TrisTris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTAEDTA等均不干等均

13、不干扰此测定法。扰此测定法。三多酚氧化酶催化活性测试三多酚氧化酶催化活性测试 酪氨酸酶的单酚酶活性，普通发生在黑色素合成途径的酪氨酸酶的单酚酶活性，普通发生在黑色素合成途径的第一步，即单酚羟化构成邻二酚。由于在酶催化反响中，第一步，即单酚羟化构成邻二酚。由于在酶催化反响中，产生的邻二酚进一步被氧化成为邻醌，所以许多研讨把产生的邻二酚进一步被氧化成为邻醌，所以许多研讨把单酚酶活性定义为完全把单酚转化为邻醌。这种活性可单酚酶活性定义为完全把单酚转化为邻醌。这种活性可以区分酪氨酸酶和其它的酚氧化酶，如漆酶和过氧化物以区分酪氨酸酶和其它的酚氧化酶，如漆酶和过氧化物酶。酶。 在自然界的各种生物体内，含有

14、许多种类的酚类化合物，在自然界的各种生物体内，含有许多种类的酚类化合物，然而只需其中的一部分可以作为多酚氧化酶或酪氨酸然而只需其中的一部分可以作为多酚氧化酶或酪氨酸酶的底物。这些酚类化合物在多酚氧化酶催化下发生酶的底物。这些酚类化合物在多酚氧化酶催化下发生一系列化学反响，最终导致水果、蔬菜产品的变色。其一系列化学反响，最终导致水果、蔬菜产品的变色。其中酪氨酸酶最重要的底物是儿茶素、多巴中酪氨酸酶最重要的底物是儿茶素、多巴3,4-3,4-二羟基二羟基苯丙氨酸、苯丙氨酸、3,4-3,4-二羟基肉桂酸酯绿原酸和酪氨酸。二羟基肉桂酸酯绿原酸和酪氨酸。 多多酚酚氧氧化化酶酶的的底底物物 多酚氧化酶也可以

15、催化许多非天然酚类化合物，但是单多酚氧化酶也可以催化许多非天然酚类化合物，但是单酚和二酚分子中取代基的位置是决议酚类化合物能否被酚和二酚分子中取代基的位置是决议酚类化合物能否被多酚氧化酶催化的一个重要要素。实验阐明多酚氧化酶多酚氧化酶催化的一个重要要素。实验阐明多酚氧化酶只能催化对位上有取代基的单酚羟基化，而邻位取代的只能催化对位上有取代基的单酚羟基化，而邻位取代的单酚和二酚由于空间位阻的缘由很难被该酶所氧化。多单酚和二酚由于空间位阻的缘由很难被该酶所氧化。多酚氧化酶也可以催化间位取代的单酚羟基化，构成的产酚氧化酶也可以催化间位取代的单酚羟基化，构成的产物同对位取代酚的氧化产物一样，但反响速度

16、低物同对位取代酚的氧化产物一样，但反响速度低4 4倍多。倍多。 OHOHHOOOHOH儿茶素OHOHCH=CHCOOCO OHOHOHOH绿原酸HOHOCH2CHCOOHNH2HOCH2CHCOOHNH2多巴酪氨酸 多酚氧化酶催化各种酚与多酚氧化酶催化各种酚与O2O2氧化为醌。本实验氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚、是采用邻苯二酚、L-L-多巴为底物，在多巴为底物，在0.2mol/L0.2mol/L磷酸钾缓冲液磷酸钾缓冲液pH6.8pH6.8的反响体系中，的反响体系中，PPOPPO催化邻催化邻苯二酚、苯二酚、L-L-多巴构成褐色的醌，在分光光度计多巴构成褐色的醌，在分光光度计390390或或47

17、5nm475nm处使反响体系的处使反响体系的ODOD值产生变化，经值产生变化，经过过ODOD值上升的读数变化确定值上升的读数变化确定PPOPPO的酶活大小。的酶活大小。 比活力的计算：将测得的每毫升酶催化活力比活力的计算：将测得的每毫升酶催化活力OD/minOD/min除上每毫升中蛋白质的含量，计算除上每毫升中蛋白质的含量，计算比活力。比活力。四多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳四多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳法是指带电荷的供试品蛋白质、核苷酸等在惰性电泳法是指带电荷的供试品蛋白质、核苷酸等在惰性支持介质如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺支持介质如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺

18、凝胶等中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各凝胶等中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进展泳动，使组分分别成狭窄的区带，用适宜的自的速度进展泳动，使组分分别成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)(%)的方法。的方法。包括纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳包括纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳不延续电泳或圆盘电泳、梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳、不延续电泳或圆盘电泳、梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳、等点聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳、等点聚焦

19、电泳以及毛细管电泳等。电泳以及毛细管电泳等。 其中聚丙烯酰胺凝胶电泳，具有分子筛和电泳的双重作用，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳，具有分子筛和电泳的双重作用，它的分辨力高，以此为电泳载体，经过电泳方法不但可以它的分辨力高，以此为电泳载体，经过电泳方法不但可以测定蛋白质的分子量大小、蛋白质的带电性质，而且可以测定蛋白质的分子量大小、蛋白质的带电性质，而且可以了解不同组织、不同发育细胞某些蛋白质表达的情况，是了解不同组织、不同发育细胞某些蛋白质表达的情况，是目前蛋白质组学研讨的重要工具之一。目前蛋白质组学研讨的重要工具之一。二、实验过程二、实验过程1 1，多酚氧化酶的粗提，多酚氧化酶的粗提1 1粗酶提取、

20、过滤，低粗酶提取、过滤，低温离心得酶提取液。温离心得酶提取液。2 2盐析；运用硫酸铵将盐析；运用硫酸铵将酶提取液沉淀、低温酶提取液沉淀、低温离心、搜集沉淀、溶离心、搜集沉淀、溶解在缓冲液中，透析解在缓冲液中，透析再再30-6030-60分钟，离心后分钟，离心后备用。备用。2 2，蛋白质含量测定，蛋白质含量测定1 1规范曲线制造。以牛血洁规范曲线制造。以牛血洁白蛋白作为规范样。浓度为白蛋白作为规范样。浓度为1mg/ml.1mg/ml.2 2酶提取液、沉淀后粗酶液酶提取液、沉淀后粗酶液蛋白含量测定。假设测试得蛋白含量测定。假设测试得到的光吸收值超越到的光吸收值超越0.60.6，需，需求对样品进展稀

21、释。求对样品进展稀释。3 3作图，计算样品蛋白含量。作图，计算样品蛋白含量。3 3，酶催化活性测定，酶催化活性测定1 1以邻苯二酚为底物测定酶催以邻苯二酚为底物测定酶催化活性；底物化活性；底物(25mmol/L)(25mmol/L)用用量量5050L L，酶液用量，酶液用量10-2010-20L L。2 2以以L-L-多巴为底物测定酶催化多巴为底物测定酶催化活性；底物活性；底物(2mg/mL)(2mg/mL)用量用量8080L L，酶液用量，酶液用量100-400100-400L L。3 3根据粗酶液蛋白浓度，计算根据粗酶液蛋白浓度，计算每毫克蛋白的活力每毫克蛋白的活力- -即比活力。即比活力。以以OD390OD390或或OD475nmOD475nm变化变化0.0010.001为一个酶活力单位为一个酶