LpPLA人血浆脂蛋白相关磷脂酶A定量检测试剂盒PPT学习教案

1、会计学1LpPLA人血浆脂蛋白相关磷脂酶人血浆脂蛋白相关磷脂酶A定量定量检测试剂盒检测试剂盒125,000+受试者受试者在国际主流专业杂志和会议报告中，已有超过在国际主流专业杂志和会议报告中，已有超过100项临床研究和项临床研究和综述分析的结果支持综述分析的结果支持Lp-PLA2 作为一个心血管疾病的标志物作为一个心血管疾病的标志物在传统危险标志物的基础上提供了新的信息在传统危险标志物的基础上提供了新的信息国际研究国际研究一致结果一致结果第1页/共47页国际权威指南国际权威指南一致推荐一致推荐 2010 ACCF/AHA 无症状成人心血管风险评估指南无症状成人心血管风险评估指南可考虑对可考虑对

2、中等风险的无症状成人中等风险的无症状成人进行进行Lp-PLA2 检测检测以进一步评估风险。以进一步评估风险。2011 AHA/ASA 卒中一级预防指南卒中一级预防指南在在未有心血管疾病的患者未有心血管疾病的患者中检测炎症指标如中检测炎症指标如hs-CRP或或Lp-PLA2可以鉴别出有可以鉴别出有较高卒中风险较高卒中风险的患者。的患者。2012 AACE 高脂血症管理与动脉粥样硬化预防指南高脂血症管理与动脉粥样硬化预防指南一些研究证明，在有一些研究证明，在有必要进一步对患者进行风险评级时必要进一步对患者进行风险评级时，Lp-PLA2检测比检测比h hs-CRP具有更高的特异性具有更高的特异性。2

3、012 ESC 欧洲心血管疾病预防临床实践指南欧洲心血管疾病预防临床实践指南对对有复发急性血栓事件的高风险患者可以检测有复发急性血栓事件的高风险患者可以检测 Lp-PLA2 以进一步评估风险以进一步评估风险。第2页/共47页国内专家国内专家一致认可一致认可“脂蛋白相关磷脂酶脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2)是血管内皮炎症的独立危险因子，也是目前是血管内皮炎症的独立危险因子，也是目前检测血管内皮炎症的新指标检测血管内皮炎症的新指标。对心脑血管栓塞性疾病的预测、治疗和预后的判断具有重要意义。对心脑血管栓塞性疾病的预测、治疗和预后的判断具有重要意义。”中华医学会心血管病学分会中华医学会心血管病学

4、分会主任委员，著名心血管专家主任委员，著名心血管专家胡大一教授胡大一教授中国工程院院士，美国心脏病中国工程院院士，美国心脏病学院院士，著名心血管专家学院院士，著名心血管专家张运教授张运教授“脂蛋白相关磷脂酶脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2)已成为已成为AS抗炎治疗的新靶点抗炎治疗的新靶点，初步研究发现通过抑制磷脂酶，初步研究发现通过抑制磷脂酶A2，可以减少血管壁脂质的沉积和巨噬细胞的浸润。，可以减少血管壁脂质的沉积和巨噬细胞的浸润。”摘自摘自动脉粥样硬化不稳定斑块的研究进展动脉粥样硬化不稳定斑块的研究进展摘自摘自2012中国脑卒中大会主题论坛报告中国脑卒中大会主题论坛报告第3页/共47页临

5、床一线临床一线期待已久期待已久 “心血管医生最关心的一点就是高危患者心血管事件发生风险。如果能够早期预防，在发生重大事件之前把危险控制住，那就可以减少病死率。但目前临床常用的检测指标如肌苷激酶等出现时为时已晚，而心血管医生最关心的一点就是高危患者心血管事件发生风险。如果能够早期预防，在发生重大事件之前把危险控制住，那就可以减少病死率。但目前临床常用的检测指标如肌苷激酶等出现时为时已晚，而脂蛋白相关磷脂酶脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测为临床提供了一个预警及风险评估的有力工具定量检测为临床提供了一个预警及风险评估的有力工具。”北京大学第三医院心内科主任北京大学第三医院心内科主任 高炜高炜 “现有的检

6、验指标如胆固醇、现有的检验指标如胆固醇、LDL、HDL确实在心血管疾病风险评估方面发挥一定作用，但并不全面。甚至有些方法如血小板活化检测还不够稳定。因此确实在心血管疾病风险评估方面发挥一定作用，但并不全面。甚至有些方法如血小板活化检测还不够稳定。因此实验室迫切需要一个方法稳定、特异性强又独立于胆固醇之外的风险评估方法，而脂蛋白相关磷脂酶实验室迫切需要一个方法稳定、特异性强又独立于胆固醇之外的风险评估方法，而脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测就提供了这样一个方法定量检测就提供了这样一个方法。” 中国医师协会检验医师分会会长中国医师协会检验医师分会会长 丛玉隆丛玉隆 “我国一年心外科手术量已达到万例，但

7、还远不能满足我国患者需要，原因就在于我国心血管疾病发病率太高，每年新增冠心病患者我国一年心外科手术量已达到万例，但还远不能满足我国患者需要，原因就在于我国心血管疾病发病率太高，每年新增冠心病患者300万。因此预防的作用比治疗更重要，并且其社会效益要远高于手术。而万。因此预防的作用比治疗更重要，并且其社会效益要远高于手术。而脂蛋白相关磷脂酶脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测为心血管疾病预防提供了一个有力武器定量检测为心血管疾病预防提供了一个有力武器。” 中国医师协会心脏外科医师分会副会长中国医师协会心脏外科医师分会副会长 孙立忠孙立忠第4页/共47页 北京北京 钓鱼台国宾馆钓鱼台国宾馆第5页/共47页

8、国家国家863高科技成果高科技成果中国中国首家首家和和唯一唯一上市产品上市产品 中国中国首家首家和和唯一唯一上市产品上市产品 国家国家863科技攻关项目高科技成果科技攻关项目高科技成果 快速监控和预测心脑血管栓塞性疾病快速监控和预测心脑血管栓塞性疾病 填补中国心脑血管疾病快速预警检测的空白填补中国心脑血管疾病快速预警检测的空白 与会专家：与会专家： 中国人民解放军总后卫生部原副部长中国人民解放军总后卫生部原副部长 陈新年陈新年 广东省卫生厅副厅长广东省卫生厅副厅长 耿庆山耿庆山 中国医药生物技术协会副会长中国医药生物技术协会副会长 于修成于修成 科技部火炬高技术产业开发中心处长科技部火炬高技术

9、产业开发中心处长 雷庆西雷庆西 中国医师协会心脏外科医师分会副会长中国医师协会心脏外科医师分会副会长 孙立忠孙立忠 中国医师协会检验医师分会会长中国医师协会检验医师分会会长 丛玉隆丛玉隆 北京大学第三医院心内科主任北京大学第三医院心内科主任 高炜高炜 北京大学首钢医院心血管医学中心主任北京大学首钢医院心血管医学中心主任 王宏宇王宏宇 卫生部北京医院心内科主任卫生部北京医院心内科主任 许峰许峰第6页/共47页心脑血管疾病是造成人类死亡的心脑血管疾病是造成人类死亡的主要病因主要病因男性女性恶 性 肿瘤心脏病 脑 血 管病呼吸系统疾病恶性肿瘤恶性肿瘤心脏病心脏病脑血管病脑血管病呼吸系统疾病呼吸系统疾

10、病来源：来源：2012中国卫生统计年鉴中国卫生统计年鉴来源来源: :美国国家健康中心美国国家健康中心2012年统计数据年统计数据第7页/共47页心脏猝死：经常是首次心脏病爆发心脏猝死：经常是首次心脏病爆发 Myerburg RJ et al. Circulation.2012;125:1043-1052第8页/共47页研发背景研发背景 动脉粥样硬化（动脉粥样硬化（AS) )是造成心脑血管疾病的主要原因是造成心脑血管疾病的主要原因 AS是一种炎症反应性疾病是一种炎症反应性疾病 在粥样斑块在粥样斑块形成、进展和最终破裂形成、进展和最终破裂的过程中均有的过程中均有炎性炎性 介质介质的参与的参与 寻找

11、一个能够反映这种动态变化过程的炎性介质就能寻找一个能够反映这种动态变化过程的炎性介质就能 够检测并跟踪动脉粥样硬化的严重程度够检测并跟踪动脉粥样硬化的严重程度 目前目前脂蛋白相关磷脂酶脂蛋白相关磷脂酶A A2 2（Lipoprotein-Associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)已被国际专家公认已被国际专家公认为一种为一种新新 的的炎性反应标志物炎性反应标志物第9页/共47页内容内容 心脑血管疾病现状及研发背景心脑血管疾病现状及研发背景 Lp-PLA2与动脉粥样硬化的关系与动脉粥样硬化的关系 临床研究临床研究 临床意义临床意义 康尔克康尔克Lp-PLA2定量检测试

12、剂盒简定量检测试剂盒简介介 产品详解与注意事项产品详解与注意事项第10页/共47页 Lp-PLA2脂蛋白相关磷脂酶脂蛋白相关磷脂酶A2，英文缩写，英文缩写Lp-PLA2。又称血小板活化因子乙酰水解酶（又称血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）。）。分子量为分子量为45KDa 。由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节。并受炎性介质的调节。 水解水解ox-LDL-C上的磷脂，生成促炎物质上的磷脂，生成促炎物质lyso-PC和和ox-FA，因此具有，因此具有促炎症和促动脉粥样促炎症和促动脉粥样硬化的作用硬化的作用 。第11页/共47页Lp-P

13、LA2在粥样斑块形成中的作用在粥样斑块形成中的作用粥样斑块形成粥样斑块形成血管腔血管腔氧化型氧化型 LDL内膜内膜中膜中膜Lp-PLA2溶血卵磷脂溶血卵磷脂氧化脂肪酸氧化脂肪酸泡沫细胞泡沫细胞单核细胞单核细胞粘附分子粘附分子巨噬细胞巨噬细胞细胞因子细胞因子第12页/共47页稳定斑块稳定斑块vs易损斑块组织学特征对比易损斑块组织学特征对比薄纤维帽薄纤维帽厚纤维帽厚纤维帽小型坏死脂质池小型坏死脂质池Lp-PLA2Lp-PLA2血管腔血管腔血管腔血管腔血栓血栓大型坏死脂质池大型坏死脂质池 稳定斑块稳定斑块 Lp-PLA2 含量较低含量较低( (深色染色深色染色) ) 纤维帽厚，胶原含量高纤维帽厚，胶

14、原含量高 小型坏死脂质池小型坏死脂质池 炎症程度较轻炎症程度较轻 易损斑块易损斑块 Lp-PLA2 含量较高含量较高( (深色染色深色染色) ) 纤维帽薄，胶原含量低纤维帽薄，胶原含量低 大型坏死脂质池大型坏死脂质池 炎症程度较重炎症程度较重Corson MA et al, Am J Card Suppl 2008:101 (41F-50F)第13页/共47页斑块易损性与其斑块易损性与其Lp-PLA2含量成正比含量成正比疾病进展疾病进展Lp-PLA2 染成棕红色染成棕红色早期斑块早期斑块出现脂质池出现脂质池稳定斑块稳定斑块纤维帽变薄纤维帽变薄，出现小型，出现小型坏死脂质核坏死脂质核易损斑块易损

15、斑块薄纤维帽薄纤维帽破裂斑块破裂斑块血管中出现血栓血管中出现血栓Kolodgie F, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006血栓第14页/共47页25 已发表研究结果显示已发表研究结果显示: :Lp-PLA2 升高升高导致心血管事件导致心血管事件风险加倍风险加倍Packard (WOSCOPS), N Engl J Med 2000 CHDBlake (WHS), J Am Coll Cardiol 2001 CHDBlankenberg (AtheroGENE), J Lipid Res 2003 - CADBallantyne (ARIC),

16、Circulation 2004 - CHD LDL 250 ng/mLhsCRP 3 mg/LLp-PLA2 CRP LDLHDLTG4%46%10%7.4%4.7%42.6%22.8%90份未患心脏病健康人群的血样份未患心脏病健康人群的血样43份健康成人份健康成人4周周7次抽血血样次抽血血样Lerman A, McConnell JP. Am J Card Supplement 2008.第20页/共47页冠心病患者冠心病患者LDL-C水平：水平：72%的患者低于的患者低于130 mg/dL 130 LDL-C (mg/dL) Get With the Guidelines databas

17、e, levels at admission Sachdeva et al. Am Heart J 第21页/共47页总胆固醇及总胆固醇及LDL-C在冠心病预测中在冠心病预测中的局限性的局限性 Framingham心脏研究心脏研究26年随访数据显示：年随访数据显示：35%冠心病患者的总胆固醇水平冠心病患者的总胆固醇水平 200 mg/dL180%发生发生MI患者与未发生患者与未发生MI患者含有相似的胆固醇水患者含有相似的胆固醇水平平冠心病患者冠心病患者LDL-C水平的中值为水平的中值为150 mg/dL1仅有仅有25%的早发性冠心病患者的发病与的早发性冠心病患者的发病与LDL-C水平升水平升高

18、有关高有关2 1Castelli W, Atherosclerosis 1996 2Genest J Jr, et al. J Am Coll Cardiol 1992第22页/共47页胆固醇并非卒中的可靠预测指标胆固醇并非卒中的可靠预测指标LDL 胆固醇胆固醇ARIC 1PROCAM 2BIP REGISTRY 3PP = NSP 未患卒中未患卒中 卒中患者卒中患者P P = NSP Ballantyne CM, et al. AHA 2004Berger K, et al. Stroke 1998Tanne D, et al. Circ.20014. Bowman TS, et al. S

19、troke 1998Oei HH, et al. Circ. 2005Wannamethee SG, et al. Stroke 2000第23页/共47页传统风险因子在冠心病患者中传统风险因子在冠心病患者中的流行程度的流行程度0 Risk Factors19.4%1 Risk Factor43%2 Risk Factors27.8%3 Risk Factors8.9%4 Risk Factors0.9%N=87,869分析的四个分析的四个传统风险传统风险因子因子: 高血高血压压，吸烟，高血脂症，糖尿病，吸烟，高血脂症，糖尿病Khot UM, et al. JAMA 2003.62.4% 冠心

20、病患者仅含有冠心病患者仅含有0-1个传统风险因子个传统风险因子第24页/共47页Mayo 研究研究: :利用利用Lp-PLA2 预测心梗后生存期预测心梗后生存期5.0* 166 ng/mL167-218 ng/mL219 ng/mL* p 0.001 after multivariate adjustment for age, sex, hypertension, BMI, diabetes, smoking, LDL-CGerber Y, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006 Hazard Ratio发生发生MI后，高水平后，高水平Lp-PLA2

21、患者患者1年内死亡风险年内死亡风险是低水平患者的是低水平患者的5倍倍第25页/共47页Mayo 研究：利用研究：利用L Lp-PLA2 预测预测冠心病患者主要心血管事件发生率冠心病患者主要心血管事件发生率95% 的的Lp-PLA2 200 ng/ml 患者患者4年内未发年内未发生心血管事件生心血管事件Brilakis ES et al. Mayo Heart Study. Euro Heart J 2005第26页/共47页北曼哈顿卒中研究北曼哈顿卒中研究( (NOMAS) ) ：利用利用Lp-PLA2 预测卒中复发风险预测卒中复发风险0.00.51.01.52.02.5High Lp-PLA

22、2High hs-CRPRisk Ratio (Highest vs. Lowest Quartile)0.71.02.1 (95% CI 1.04-4.18)1.9(95% CI 1.01-3.42)复发性卒中事件复发性卒中事件 N=80, 其他心血管事件其他心血管事件 N=122Adjusted for demographics, traditional risk factors, stroke severity, and both markers复发性卒中复发性卒中首发卒中后任何心血管事件首发卒中后任何心血管事件Elkind MS, et al. Arch Int Med 2006.Lp

23、-PLA2 升高，卒中复发风险加倍升高，卒中复发风险加倍第27页/共47页一级预防一级预防对急性冠脉综合征的预测评价对急性冠脉综合征的预测评价 经冠脉造影证实无冠脉狭窄者经冠脉造影证实无冠脉狭窄者(对照对照)28例、急性冠例、急性冠脉综合征脉综合征(ACS)27例、稳定型心绞痛例、稳定型心绞痛(SAP)28例。检测血例。检测血浆浆Lp-PLA2 水平。水平。 组别组别 例数例数 Lp-PLA2(ng/ml) 急性冠脉综合征急性冠脉综合征(ACS) 27 706.00149.91* 稳定型心绞痛稳定型心绞痛(SAP) 2 427.7544.58* 无冠脉狭窄者无冠脉狭窄者(对照组对照组) 28

24、267.6992.67 注注: 与对照组比较与对照组比较 *P0. 001陈锦峰陈锦峰, ,等等. .广东医学广东医学 2011;32(10):1263第28页/共47页二级预防二级预防对进展性脑梗死的预测评价对进展性脑梗死的预测评价 168 例急性脑梗死例急性脑梗死(ACI) 患者每天进行患者每天进行NIH卒中卒中量表量表(NIHSS) 评分，其中进展性脑梗死评分，其中进展性脑梗死40例，稳定性脑例，稳定性脑梗死梗死128例。检测血浆例。检测血浆Lp-PLA2 水平。水平。 组别组别 例数例数 Lp-PLA2(g/L) ACI组组 168 12.0587.104* 进展性脑梗死组进展性脑梗死

25、组 40 17.30410.630* 稳定性脑梗死组稳定性脑梗死组 正常对照组正常对照组 注注: 与正常对照组比较与正常对照组比较 *P 0. 01; 与稳定性脑梗死组比较与稳定性脑梗死组比较 P 0. 01王磊王磊, ,等等. .临床神经病学杂志临床神经病学杂志 2011;24(4):309. .第29页/共47页病情评估病情评估对神经功能损伤程度的评价对神经功能损伤程度的评价 选择动脉硬化性脑梗死选择动脉硬化性脑梗死(ACI) 患者患者128例和未卒中对照者例和未卒中对照者88例为研究对象，检测血浆例为研究对象，检测血浆Lp-PLA2的水平。按的水平。按NIH中风量表中风量表(NIHSS

26、评分评分)进行神经功能缺损程度评估。分析神经功能缺损进行神经功能缺损程度评估。分析神经功能缺损程度与血浆程度与血浆Lp-PLA2水平相关性。结果，。水平相关性。结果，。 组别组别 例数例数 Lp-PLA2(g/L) 轻型梗死组轻型梗死组 32 53.455.47* 中型梗死组中型梗死组 66 65.686.07* 重型梗死组重型梗死组 注注: 梁江红梁江红, ,等等. .实用医学杂志实用医学杂志2009;25(14):2264.第30页/共47页 疗效评价疗效评价 不同剂量阿托伐他汀治疗急性脑梗死不同剂量阿托伐他汀治疗急性脑梗死 选择急性脑梗死患者选择急性脑梗死患者86例，例， 随机分为随机分

27、为2组：阿托伐他汀常组：阿托伐他汀常规剂量组规剂量组43例：例：20mg/天，大剂量组天，大剂量组43例：例：40mg/天，天， 分别于分别于治疗前及治疗治疗前及治疗14天后测量患者血浆天后测量患者血浆Lp-PLA2 水平。另选择水平。另选择43例健康体检者为对照组，不予阿托伐他汀治疗。例健康体检者为对照组，不予阿托伐他汀治疗。阿托伐他汀治疗前后阿托伐他汀治疗前后血浆血浆Lp-PLA2(g/L)变化的比较变化的比较 常规治疗组常规治疗组 大剂量组大剂量组 对照组对照组 急性脑梗死组急性脑梗死组 治疗前治疗前 治疗后治疗后 治疗前治疗前 治疗治疗 30.522.91 # 44.226.25 37

28、.634.53* 43.695.16 35.634.16* 注注: 治疗前和治疗后比较治疗前和治疗后比较 *P175 ng/ml175 ng/ml175ng/ml175ng/ml4.0 mmol/L 3.3 mmol/L2.5 mmol/L1.8 mmol/L测试测试测量中高危患者的测量中高危患者的Lp-PLA2 水平水平治疗治疗达到合适达到合适LDL-C水平水平第34页/共47页 产品组成及安全性 本试剂盒中采用的试剂都不具有毒本试剂盒中采用的试剂都不具有毒性、致畸致突变性，也不含有人血液制性、致畸致突变性，也不含有人血液制品，因此不具有生物学危害，但仍需作品，因此不具有生物学危害，但仍需作

29、为一般生物试剂加以防护。为一般生物试剂加以防护。第35页/共47页检验原理检验原理ELISA第36页/共47页样品处理样品处理样品收集、处理和保存：样品收集、处理和保存：血浆：用血浆：用EDTA抗凝管取血抗凝管取血2ml，1500 r/min离心离心10分钟，收集上清液。分钟，收集上清液。血清：用普通管或促凝管取血血清：用普通管或促凝管取血2ml，4下放置下放置30分钟后，分钟后，1500 r/min离心离心10分钟，收集上清液。分钟，收集上清液。保存保存: : 血浆（清）如不即时检测，则须于血浆（清）如不即时检测，则须于-20保保存，并避免反复冻融存，并避免反复冻融。第37页/共47页操作方

30、法操作方法 1） 从冰箱中取出试剂盒，室温平衡从冰箱中取出试剂盒，室温平衡20min，将标准品离心，将标准品离心，1000r/min，1min 2）分别加入分别加入80ul稀释液（稀释液（1倍倍) )和和20ul待测样品或标准品于反应孔内待测样品或标准品于反应孔内, ,混匀混匀, ,37温育温育20min3）弃去孔内液体，每孔加弃去孔内液体，每孔加300ul洗液洗液( (1倍），振荡倍），振荡20-30sec后弃去洗液，重复后弃去洗液，重复4次，拍干残液次，拍干残液4）加入加入100ul酶标记物，混匀，酶标记物，混匀，37温育温育30min 5）重复步骤重复步骤 3） 6）每孔加入显色液每孔加

31、入显色液100ul，混匀，混匀，37温育温育20min，避光，避光7）加入加入50ul终止液终止液8）立即用酶标仪在立即用酶标仪在450nm条件下测定各孔条件下测定各孔OD值值9）以以OD值为纵坐标（值为纵坐标（Y），相应），相应Lp-PLA2标准品浓度为横坐标（标准品浓度为横坐标（X），制作标准曲线），制作标准曲线10）根据样品的根据样品的OD值计算得出样品的值计算得出样品的Lp-PLA2含量含量第38页/共47页检验结果的解释检验结果的解释对临床的检测结果进行统计分析之后，对临床的检测结果进行统计分析之后，175ng/ml以下正常以下正常, , 175ng/ml以上为危险以上为危险。如样本

32、的如样本的Lp-PLA2的含量低于临界值，则的含量低于临界值，则视为正常；如高于临界值则提示为其动脉视为正常；如高于临界值则提示为其动脉可能有粥样硬化炎症，且炎症与可能有粥样硬化炎症，且炎症与Lp-PLA2的含量成正比。的含量成正比。 第39页/共47页产品性能指标产品性能指标 剂量剂量- -反应曲线的线性反应曲线的线性 用logistic数学模型或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数（r）应不低于。r2r2第40页/共47页 准确性准确性试剂盒标准品与相应浓度的企业校准品同时进行分析测定，用logistic数学模型或其他数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行（t检验，），以企业校准品为对照品，试剂盒标准品的实测值与标示值的效价比的平均值应在范围内。 灵敏度灵敏度试剂盒的最小检测值10ng/ml。 产品性能指标产品性能指标第41页/共47页 精密度精密度批内变异度（CV%）和批间变异度（CV%）均应不高于15.0% 特异性特异性以试剂盒测定下列物质，测定值应符合要求： 人血清白蛋白（浓度60mg/mL）、癌胚抗原(浓度100ng/mL），在本试剂盒上的测定结果OD值应不高于。 稳定性稳定性试剂盒在2-8条件放置6个月，检测结果应符合上述几项要求。 产品性能指标产品性能指标第42页/共47页开封开封/ /瓶后，酶联反应板放入铝箔袋中封