第八章吸光光度法

1、第八章第八章 吸光光度法吸光光度法 白光白光( (太阳光太阳光) )：由：由400-7400-760 nm60 nm波长的波长的各种单色各种单色 光组成的复合光光组成的复合光单色光单色光：单波长的光：单波长的光 肉眼观察到的颜色肉眼观察到的颜色 ？ 红外区：红外区： 770nm 770nm - - 1mm 1mm 可见光区：可见光区：400-7400-760 nm60 nm 近紫外区：近紫外区：200 - 400 200 - 400 nm 远紫外区：远紫外区：10 - 200 10 - 200 nm一一 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理（一）光知识基础（一）光知识基础（红光：（红光：6

2、20760nm）实验证明：溶液的颜色是由于溶液中的有色实验证明：溶液的颜色是由于溶液中的有色物质吸收了某一波长的光所造成的。物质吸收了某一波长的光所造成的。溶液所溶液所呈现呈现的的颜色颜色是其对不同波长的是其对不同波长的可可见光选择性吸收见光选择性吸收的结果。的结果。互补色光：互补色光：如果把适当如果把适当颜色的两种单色光按一颜色的两种单色光按一定强度比例混合，可以定强度比例混合，可以成为白光，这两种颜色成为白光，这两种颜色称为互补色。称为互补色。 光知识基础光知识基础 溶液溶液呈现呈现的是与它的是与它吸收吸收的的光成光成互补色互补色的光的颜色的光的颜色 一束平行一束平行单色光单色光Io照射溶

3、液时，照射溶液时，光的一部分被光的一部分被吸收吸收或被器皿的表面或被器皿的表面反射反射 ，一部分，一部分透过透过溶液溶液It 。透光率透光率T（透光度）：（透光度）： 描述入射光透过溶液的程度，即透过光强描述入射光透过溶液的程度，即透过光强度度It与入射光强度与入射光强度Io之比，用之比，用 T 表示：表示：0IITtl 溶液的透光度越大，说明对光的吸收越小，溶液的透光度越大，说明对光的吸收越小，透光度越小，说明溶液对光的吸收越大。透光度越小，说明溶液对光的吸收越大。l吸光度吸光度A：描述溶液对光的吸收程度：描述溶液对光的吸收程度lA值越大，溶液中吸光物质对单色光值越大，溶液中吸光物质对单色光

4、 的吸收程度越大；反之亦然。的吸收程度越大；反之亦然。 将不同波长的光依次透过某浓度一定的将不同波长的光依次透过某浓度一定的溶液，测量不同波长下溶液对光的吸光度，溶液，测量不同波长下溶液对光的吸光度，用用A A作图作图（二）光吸收曲线（二）光吸收曲线某某溶液的溶液的光光吸收曲线吸收曲线光吸收曲线的讨论：光吸收曲线的讨论： 1 相同浓度同一种物质对不同波长光的吸光度不同。相同浓度同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长最大吸收波长max。同一种物质的最大吸收波长相同。同一种物质的最大吸收波长相同。2 不同浓度的同一种物质，不同浓度的同一

5、种物质，吸光度随浓度增大而增大吸光度随浓度增大而增大，在在max处差异最大，此特性可作为物质处差异最大，此特性可作为物质定量分析定量分析的的依据。吸收曲线是定量分析中选择依据。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长入射光波长的重要的重要依据。依据。525不同浓度高锰酸钾溶液不同浓度高锰酸钾溶液光吸收曲线光吸收曲线 3 不同浓度的同一种物质，其吸收曲不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似线形状相似max不变。而对于不同物质，不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和它们的吸收曲线形状和max则不同。则不同。定性定性分析依据分析依据MnO4-Cr2O72-（三）（三） 光吸收定律光吸收定律 1 1

6、透光率透光率T T与吸光度与吸光度A A 若光全部透过溶液：若光全部透过溶液： T T1 1（100%100%），）， I It t = I = I0 0 ，A = 0 A = 0 若全部被吸收：若全部被吸收： T T0 0 （0%0%），）， I It t = 0 = 0 ，A = A = 吸光度吸光度A A与透光度与透光度T T的关系的关系: : A A lg lg T T 2 朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格( (Bouguer)Bouguer)和朗伯和朗伯( (Lambert)Lambert) ： A Ab b（液层厚度）（液层厚度） 18521852年比耳年比耳( (Beer)Be

7、er) ： A A c c （溶液浓度）（溶液浓度） 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律。比耳定律。2 朗伯朗伯比耳定律比耳定律 朗伯朗伯比尔定律比尔定律( (只适用于稀溶液只适用于稀溶液) ) 一束平行单色光通过溶液时，溶液的一束平行单色光通过溶液时，溶液的吸光度吸光度A A与溶液与溶液 的浓度的浓度c c 和液层厚度和液层厚度b b成正成正比：比： A = K b c A = K b c A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b： 液层厚度液层厚度(光程长度光程长度) c：溶液的浓度溶液的浓度； K：吸光系数，吸光系数，表示物质对光的吸收能力表示物

8、质对光的吸收能力, , （与（与入射光的波长、物质性质、溶液温度入射光的波长、物质性质、溶液温度有有关）关） 根据朗伯根据朗伯比尔定律，溶液在比尔定律，溶液在一定波长处一定波长处的的吸光度与浓度之间有线性关系，因此可以利吸光度与浓度之间有线性关系，因此可以利用溶液的吸光度求出浓度。用溶液的吸光度求出浓度。 朗伯朗伯比耳定律只适用于比耳定律只适用于稀溶液稀溶液 （0.01mol/L以下）以下） 非单色光或溶液浓度太高等原因均可能非单色光或溶液浓度太高等原因均可能引起朗伯比耳定律的偏离。引起朗伯比耳定律的偏离。A = K b cA = K b c二二 吸光光度法吸光光度法 比色分析法比色分析法：利

9、用比较溶液颜色的深浅：利用比较溶液颜色的深浅来测定物质浓度的方法称为比色分析法。来测定物质浓度的方法称为比色分析法。( (可见光可见光) ) 分光光度法分光光度法：若使用分光光度计进行分析：若使用分光光度计进行分析测定称为分光光度法。测定称为分光光度法。吸吸光光光光度度法法吸光光度法吸光光度法：基于物质对光的选择性：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。吸收而建立起来的分析方法。 （一）比色分析法（一）比色分析法（包括目视比色法和光电比色法）（包括目视比色法和光电比色法）标准系列法（常用）：标准系列法（常用）：比色管比色管目视比色法特点目视比色法特点a. a. 利用自然光，目测，方法简

10、便，利用自然光，目测，方法简便，无需特殊仪器无需特殊仪器; ; b. b. 比色管液层厚，灵敏度较高比色管液层厚，灵敏度较高; ; c. c. 准确度低（与分光光度法相比）准确度低（与分光光度法相比）; ; d. d. 不可分辨多组分不可分辨多组分. （二）分光光度法（二）分光光度法（1）工作曲线法（标准曲线法）工作曲线法（标准曲线法）（2）标准试样计算法或比较法）标准试样计算法或比较法（3）计算分光光度法）计算分光光度法 多组分的定量方法（了解）多组分的定量方法（了解）1 测定方法测定方法 先配制一系列标准溶液，先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们在最大吸收波长处，测出它们的吸光

11、度（分光光度计）。的吸光度（分光光度计）。cA标准工作曲线图标准工作曲线图Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A5（1 1） 工作曲线法工作曲线法 作图，得到一条直线，称为标作图，得到一条直线，称为标准曲线或工作曲线，同条件测未知准曲线或工作曲线，同条件测未知液的吸光度，从标准曲线上查出未液的吸光度，从标准曲线上查出未知液的浓度。知液的浓度。例：磺基水杨酸分光光度法测定铁的含量例：磺基水杨酸分光光度法测定铁的含量 不同浓度标准铁（不同浓度标准铁（FeFe3+3+）溶液加入有关试剂后（）溶液加入有关试剂后（ 在在pH 811的氨性溶液中的氨性溶液中 黄），（黄），（420nm420nm）

12、测得吸光度。）测得吸光度。 0.02.02.04.04.06.06.08.08.010.010.012.012.0 0.0000.0970.0970.2000.2000.3040.3040.4080.4080.5100.5100.6130.613 空白液调零，相同条件下，测得试样溶液的吸光度为空白液调零，相同条件下，测得试样溶液的吸光度为0.4130.413，求试样溶液中的铁含量。，求试样溶液中的铁含量。 (用作图纸或用回归直线方用作图纸或用回归直线方程进行计算程进行计算)标准铁标准铁溶液浓度溶液浓度（g/mL）吸光度吸光度（2） 标准试样计算法或比较法（对照法）标准试样计算法或比较法（对照法

13、）A标标K K标标b b标标 c c标标A样样K K样样b b样样 c c样样 因是同种物质，同台仪器，相同厚度吸收因是同种物质，同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长测定，故：池及同一波长测定，故： K标标K样样，b标标b样样: 标标样样cAAc注注：为了减少误差，比较法配制的标准溶：为了减少误差，比较法配制的标准溶 液浓度常与样品溶液的浓度相接近。液浓度常与样品溶液的浓度相接近。样标样标ccAA 用分光光度法测铁，在一定条件下用分光光度法测铁，在一定条件下测得浓度为测得浓度为4.0mg/mL铁标准溶液的铁标准溶液的吸光度为吸光度为0.400。在同样条件下，测。在同样条件下，测得试样的吸光度为得

14、试样的吸光度为0.385，试求试样，试求试样的铁含量为多少？的铁含量为多少？2 分光光度法特点分光光度法特点 分光光度计分光光度计 入射光为单色光入射光为单色光 灵敏度高灵敏度高 准确度较高准确度较高 可同时多组分测定而无需分离可同时多组分测定而无需分离 可以测无色物质可以测无色物质（三）（三） 分光光度计分光光度计722型分光光度计型分光光度计l 可见分光光度计：可见分光光度计：721721、722 722 、723723 （可见光区：（可见光区：4004007 760nm60nm）l 紫外可见分光光度计：紫外可见分光光度计： 751 751、752752、754754、UV2501UV25

15、01等等 （近紫（近紫200200400400nmnm）（主要用于测物质含量。（主要用于测物质含量。) )l 红外分光光度计（红外区）红外分光光度计（红外区），( (一般用于有机物结构分析。一般用于有机物结构分析。) )基基 本本 组组 成成1 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱可以发射连续光谱，具，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯可见光区：钨灯。紫外区：氢、氘灯。紫外区：氢、氘灯。 将光源发射的复合光分解成单色光并可从将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任何波长

16、单色光的光学系统。中选出一任何波长单色光的光学系统。 滤光片滤光片 分光棱镜（折射）分光棱镜（折射） 光栅（衍射和干涉）光栅（衍射和干涉） 2 单色器单色器棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 5004003 吸收池（样品室）吸收池（样品室） 样品室放置各种类型的吸收池（样品室放置各种类型的吸收池（比色皿比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池紫外

17、区须采用石英池，可，可见区一般用玻璃池。见区一般用玻璃池。4 检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，并转化为吸光度。常用的成可测的电信号，并转化为吸光度。常用的有光电池、光电管或光电倍增管。有光电池、光电管或光电倍增管。5 结果显示记录系统结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理控制和结果处理注：普通分光光度计使用的注：普通分光光度计使用的A值最适宜读数范围值最适宜读数范围为为0.20.8（考虑到仪器透光度读数误差）（考虑到仪器透光度读数误差）几种光路类型的几种光路类型的紫外

18、可见分光光度计紫外可见分光光度计 分类：分类： 1 单波长分光光度计：单波长分光光度计： 单光束分光光度计单光束分光光度计 双光束分光光度计双光束分光光度计 2 双波长分光光度计双波长分光光度计 双光束分光光度计双光束分光光度计光源光源单色器单色器参比溶液参比溶液检测器检测器样品溶液样品溶液特点：对参比信号和试样信号的测量几乎是同步进特点：对参比信号和试样信号的测量几乎是同步进行的，补偿了光源和检测系统的不稳定性。行的，补偿了光源和检测系统的不稳定性。同步旋转镜同步旋转镜调制器调制器双波长分光光度计双波长分光光度计 光源光源单色器单色器单色器单色器切切光光器器吸收池吸收池检测器检测器1 12

19、2特点：采用双单色器，可通过波长选择校正背景吸特点：采用双单色器，可通过波长选择校正背景吸收，适用于混浊液和多组分定量分析。收，适用于混浊液和多组分定量分析。三三 显色反应和测量条件的选择显色反应和测量条件的选择 使试样中的使试样中的待测物待测物与化学试剂（与化学试剂（显显色剂色剂）作用生成）作用生成有色化合物有色化合物的反应叫的反应叫显显色反应色反应。 mX nR XmRn （待测物）待测物） （显色剂）显色剂） （有色化合物）有色化合物） 显色反应主要有配位反应和氧化还显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是原反应，其中绝大多数是配位反应配位反应。 （一）（一） 显色反应显色反

20、应影响显色反应的因素影响显色反应的因素 (1) 显色剂用量显色剂用量（2）溶液的酸度）溶液的酸度（3）显色时间）显色时间（4）显色温度）显色温度（5）溶剂）溶剂（6）共存干扰离子的影响）共存干扰离子的影响（二）测量条件的选择（二）测量条件的选择 1 1 入射光波长的选择入射光波长的选择 一般选择最大吸收波长（灵敏度高）一般选择最大吸收波长（灵敏度高） （也可考虑灵敏度较低但干扰较少的波长）（也可考虑灵敏度较低但干扰较少的波长）2 2 参比溶液的选择参比溶液的选择（考虑因素：样液、显色剂、加入的其他试剂是否有干扰）（考虑因素：样液、显色剂、加入的其他试剂是否有干扰）（1 1）溶剂空白）溶剂空白蒸

21、馏水蒸馏水（2 2）试样空白）试样空白样液样液+ +蒸馏水蒸馏水（3 3）试剂空白）试剂空白显色剂显色剂+ +试剂试剂+ +蒸馏水蒸馏水3 3 吸光度测量范围的控制吸光度测量范围的控制适宜读数：适宜读数：0.20.8控制手段：（控制手段：（1）选择合适的比色皿厚度）选择合适的比色皿厚度 （2）调整试样溶液的浓度）调整试样溶液的浓度四四 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1 微量磷的测定微量磷的测定原理原理：磷酸盐钼酸铵：磷酸盐钼酸铵 酸性溶液酸性溶液 磷钼酸（黄色）磷钼酸（黄色） 磷钼酸磷钼酸 还原剂还原剂 （Sncl2或抗坏血酸）或抗坏血酸） 磷钼蓝（蓝色）磷钼蓝（蓝色） （690700nm）

22、步骤步骤：含磷标准溶液含磷标准溶液 显色显色 比色（测吸光度）比色（测吸光度） 绘制标绘制标准曲线准曲线被测液被测液 显色显色 比色（测吸光度）比色（测吸光度） 查曲线，计算查曲线，计算邻菲啰啉分光光度法测定水中微量铁邻菲啰啉分光光度法测定水中微量铁 （国标法）（国标法） Fe2+邻菲啰啉邻菲啰啉 （pH29） 橙红色配位化合物橙红色配位化合物（510nm处，吸光度与浓度呈线性关系）处，吸光度与浓度呈线性关系）l 该法选择性高，大部分金属离子不影响，该法选择性高，大部分金属离子不影响，若待测液中含有若待测液中含有Fe3+离子，则可预先用离子，则可预先用还原剂还原，测定还原剂还原，测定Fe2+和和Fe3+总量。总量。2 微量铁的测定微量铁的测定通常测定时用缓冲通常测定时用缓冲溶液将溶液将pH调到调到5，减少干扰减少干扰第八章要求掌握知识点第八章要求掌握知识点1 复合光与单色光、可见光波长范围、物质呈复合光与单色光、可见光波长范围、物质呈现颜色的原因、互补光。现颜色的原因、互补光。2 光吸收曲线要点、最大吸收波长光吸收曲线要点、最大吸收波长3 朗伯比耳定律的理解：朗伯比耳定律的理解： A = K b c lg T 吸光系数的物理意义和影响因素吸光系数的物