实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

1、2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-101碱性磷酸酶的提取及其碱性磷酸酶的提取及其比活性测定比活性测定带教带教: 张学礼、戴薇薇张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍龚张斌、黎志萍2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-102材料选择材料选择细胞的破碎细胞的破碎分离纯化分离纯化鉴定鉴定2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-103 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 (ALP , AKP) (ALP , AKP) Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase2021/6/162009-5-1

2、02009-5-102009-5-104一、实验目的一、实验目的1 1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；的原理和方法；2 2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；得率及纯化倍数的概念及计算；3 3、了解、了解AKPAKP的临床意义及纯化的临床意义及纯化蛋白质蛋白质的一般方的一般方法法。2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-105二、实验原理二、实验原理1、 AKP概述概述 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷

3、酸基的作用最适最适pHpH：8.68.610.310.3 特点：特异性低特点：特异性低2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-106体内位置：细胞膜表面体内位置：细胞膜表面 - -肾小管的筛状缘肾小管的筛状缘 - -肠粘膜的微绒毛肠粘膜的微绒毛 - -胆小管的细胞膜缘胆小管的细胞膜缘 - -肝窦状腺表面肝窦状腺表面 - -胎盘合体细胞滋养层细胞外表面胎盘合体细胞滋养层细胞外表面2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-107正常血清正常血清： ALP ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半

4、。性的一半。临床意义：血清临床意义：血清ALPALP活力增高活力增高常见于常见于 - -肝胆疾病（胆道阻塞等）肝胆疾病（胆道阻塞等） - -骨骼疾病（佝偻病等）骨骼疾病（佝偻病等） - -甲状腺功能亢进甲状腺功能亢进 - -妊娠和生长期儿童妊娠和生长期儿童2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1082、AKP的分离、提取、及纯化的分离、提取、及纯化整个制备过程可分为整个制备过程可分为 5 个阶段：个阶段：材料的选择和预处理，材料的选择和预处理，细胞的破碎，细胞的破碎，提取，提取，纯化（包括盐析纯化（包括盐析、有机溶剂提取有机溶剂提取、层析、电泳、层析、电泳等），等

5、），浓缩、干燥及保存。浓缩、干燥及保存。2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-109 取材取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织组织本次实验：肝脏本次实验：肝脏2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1010 生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎机械破碎法机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵高速组织捣碎机、匀浆器、研钵渗透破碎法渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎低渗条件使细胞溶胀而破碎 反复冻融法反复冻融法 ：超声波法：超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而超声波震荡器使细胞膜上所受

6、张力不均而使细胞破碎使细胞破碎 酶法酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞如用溶菌酶破坏微生物细胞 2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1011 选择合适分离提取方法选择合适分离提取方法把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉把酶从溶液中提取出来把酶从溶液中提取出来2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1012有机溶剂方法有机溶剂方法 有机溶剂分段沉淀法有机溶剂分段沉淀法原理：原理： 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂利用不同的蛋白质在不同浓

7、度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。中有不同的溶解度而进行分离。2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1013有机溶剂：有机溶剂： 正丁醇正丁醇 能去除与能去除与pro结合的脂类物质，使结合的脂类物质，使pro溶解在溶溶解在溶液中液中 乙醇乙醇 30% AKP 溶解状态溶解状态 60% AKP 沉淀状态沉淀状态 丙酮丙酮 33% AKP 溶解状态溶解状态 50% AKP 沉淀状态沉淀状态通过离心，去除通过离心，去除部分杂蛋白部分杂蛋白通过离心，进一通过离心，进一步去除杂蛋白步去除杂蛋白2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1014

8、 保护酶活性措施保护酶活性措施低温条件下操作低温条件下操作所有试管均需洗干净所有试管均需洗干净选择合适的选择合适的pHpH及合适的缓冲体系，以稳定及合适的缓冲体系，以稳定酶活性酶活性Mg(Ac)2 NaAc 混合液提取混合液提取AKPpH 8.8 Tris 缓冲液测缓冲液测AKP活性活性保护和稳定保护和稳定AKP 2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1015 2g新鲜兔肝剪碎新鲜兔肝剪碎匀浆管匀浆管 加加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液混合液2ml ，匀浆，匀浆 匀浆液入离心管匀浆液入离心管 用用4ml上述混合液冲洗匀浆器上述混合液冲

9、洗匀浆器，并倒，并倒 入离心管，混匀，记体积入离心管，混匀，记体积VA A液液A1管管 A2管管 剩余剩余A液液0.1 ml A液液 + 0.1 ml A液液 +4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 4.9 ml 生理盐水生理盐水 三、操作步骤三、操作步骤（待测酶活性）（待测酶活性）（待测蛋白质含量）（待测蛋白质含量）加加2ml正丁醇，搅拌正丁醇，搅拌3-5，室温放置，室温放置30，过滤，入离心管过滤，入离心管2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1016 上述滤液上述滤液 加加等体积等体积冷丙酮，混匀，冷丙酮，混匀， 离心离心2000 rpm、5分钟

10、分钟上清入回收瓶上清入回收瓶 沉淀沉淀 加加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2, 搅拌，记体积搅拌，记体积VB B液液 0.10ml B 液液 + + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris B1管管 B2管管 剩余剩余B液液VB0.1 ml B液液 +4.9 ml 生理盐水生理盐水 加加 0.45VB 冷冷乙醇乙醇96% 30% ，混匀，混匀， 离心离心 2500 rpm ,5 分钟分钟 （待测酶活性）（待测酶活性）（待测蛋白质含量）（待测蛋白质含量）2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1017上清上清 弃沉淀弃沉淀入离心管入离心管 ，记体积，

11、记体积VB，加加 0.83 VB冷冷乙醇乙醇 96%（30% 60% ） 混匀，混匀， 离心离心 2500 rpm ,5 分钟分钟 上清入回收瓶上清入回收瓶 沉淀沉淀加加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液混合液4ml ，搅拌，搅拌，记体积记体积Vc C液液C1管管 C2管管 剩余剩余C液液Vc 0.10ml C 液液 + + 1.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 0.1 ml C液液 +0.4 ml 生理盐水生理盐水 加加0.50.5Vc冷冷丙酮丙酮 33% ，混匀混匀, ,离心离心 2000 rpm ,5 分钟分钟 （待测酶活性）（待测酶活性）（待测蛋白

12、质含量）（待测蛋白质含量）上述离心结果上述离心结果2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1018上清上清 弃沉淀弃沉淀上清入回收瓶上清入回收瓶 沉淀沉淀加加 5ml 0.01M pH 8.8 Tris ，搅拌，搅拌，记体积记体积VD D液液D1管管 D2管管 0.10ml D 液液 + + 0.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 入离心管入离心管 ，记体积，记体积Vc,加加1/3 1/3 Vc冷冷丙酮丙酮 50% ，混匀，混匀， 离心离心 2000 rpm ,5 分钟分钟 剩余剩余D液液（待测酶活性）（待测酶活性）（直接待测蛋白质含量）（直接待测蛋白质含

13、量）上述离心结果上述离心结果2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1019比活性：比活性： 指单位指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位 比活性比活性= = 酶活性单位数酶活性单位数 / mg / mg 蛋白蛋白 二、实验原理二、实验原理3 3、建立测定酶比活性的方法、建立测定酶比活性的方法 2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1020磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法原理：原理： 磷酸苯二钠磷酸苯二钠AKP苯酚苯酚K3Fe (CN) 64- 氨基氨基-安替比林安替比林醌类化合物醌类化合物= 510nm 测

14、定酶活性测定酶活性2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1021AKP活性单位定义活性单位定义:37,反应反应15分钟分钟,产生产生1ug苯酚苯酚 一个一个AKP活性单位活性单位（u）2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1022试剂试剂(ml)B1234A1稀释液稀释液0.10B1稀释液稀释液0.10C1稀释液稀释液0.10D1稀释液稀释液0.10pH8.8 Tris 缓冲液缓冲液0.10复合基质液复合基质液33333 立即混匀。将各管置于立即混匀。将各管置于3737水浴精确保温水浴精确保温1515分钟分钟0.5%K3Fe(CN)6

15、22222 立即混匀。终止酶促反应，室温静置立即混匀。终止酶促反应，室温静置10分钟。分钟。H2O调零，调零， =510nm比色，记录各管比色，记录各管OD。2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1023计算酶活性：计算酶活性： 各制剂总各制剂总AKP单位数（单位数（U）= 查表所得值查表所得值 稀释倍数稀释倍数 总体积总体积注：注：A1、B1、C1、D液分别稀释液分别稀释50、50、20、10倍倍（标准曲线）（标准曲线）2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1024 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 （Coomassie Brilliant

16、 Blue G-250 ，Bradford法）法） 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250红色和蓝色红色和蓝色 酸性游离状态酸性游离状态棕红色棕红色 465nm+蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质-染料复合物染料复合物595nm 测定蛋白质含量测定蛋白质含量2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1025试剂试剂(ml)B1234生理盐水生理盐水0.10A2稀释液稀释液0.10B2稀释液稀释液0.10C2稀释液稀释液0.10溶液溶液D0.10考马斯亮兰试剂考马斯亮兰试剂55555 混匀。混匀。2分钟后，分钟后，H2O调零，调零，=595nm比色，记录各管比色，记录各管OD。2021/

17、6/162009-5-102009-5-102009-5-1026计算蛋白质含量：计算蛋白质含量： 各制剂总蛋白含量（各制剂总蛋白含量（mg）= 查表所得值查表所得值 稀释倍数稀释倍数 总体积总体积注：注：A2、B2、C2液分别稀释液分别稀释 50、50、5 倍倍2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1027 各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算1、AKP比活性：比活性：AKP比活性（比活性（U/mg）= 每每ml制剂中制剂中AKP活性单位数（活性单位数（U）每每ml制剂中蛋白质含量（制剂中蛋白质含量（mg）2021/6/162

18、009-5-102009-5-102009-5-10282、得率、得率得率得率 = 每一制剂中总的酶活性单位每一制剂中总的酶活性单位溶液溶液A中总的酶活性单位中总的酶活性单位100%2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-10293、纯化倍数、纯化倍数纯化倍数纯化倍数 = 每一制剂每一制剂AKP比活性（比活性（U/mg）溶液溶液A制剂制剂AKP比活性（比活性（U/mg）2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1030匀浆匀浆A A液液第一次丙酮提第一次丙酮提取（取（B B液）液）第二次乙醇提第二次乙醇提取（取（CC液）液）第三次丙酮提第三

19、次丙酮提取（取（D D液）液）总体积（总体积（mlml）蛋白含量（蛋白含量（mg/mlmg/ml）总蛋白量（总蛋白量（mgmg）AKPAKP活性单位（活性单位（u/mlu/ml）总总AKPAKP活性单位（活性单位（u u）比活性（比活性（u/mgu/mg）纯化倍数纯化倍数得率得率AKP分离纯化小结表：分离纯化小结表：2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1031有机溶剂体积的计算有机溶剂体积的计算96%乙醇乙醇VB/中加乙醇中加乙醇96% 30%（VB/ + VX） 30% = 96% VXVX = 0.45 VB/ VB/ /中加乙醇（中加乙醇（96% ）从）从30% 60%（VB/ / + VX） 60% - VB/ / 30% = 96% VXVX = 5/6（0.83） VB/ /2021/6/162009-5-102009-5-102009-5-1032