放射配基受体结合法-1 (1)

1、放射配基受体结合法放射配基受体结合法 Radio Ligand Receptor Binding Assay（RRA） 实验药理学实验药理学 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所中国医学科学院北京协和医学院药物研究所 放射配基结合测定法是可以定量测定配基放射配基结合测定法是可以定量测定配基与受体结合的参数的一种方法。与受体结合的参数的一种方法。与受体结合的与受体结合的配基可以是激素、神经递质、生长因子等内源配基可以是激素、神经递质、生长因子等内源性物质和相关药物。性物质和相关药物。 放射配基结合测定法的基本操作是比较简放射配基结合测定法的基本操作是比较简单的，将含有受体的制备物与适当的放射配

2、基单的，将含有受体的制备物与适当的放射配基一起温孵一段适当的时间，然后对与受体结合一起温孵一段适当的时间，然后对与受体结合的放射活性进行测定。的放射活性进行测定。 主要包括三种类型的实验：饱和实验，竞主要包括三种类型的实验：饱和实验，竞争实验和动力学实验。争实验和动力学实验。 我们将依次介绍受体制备，放射配基，检我们将依次介绍受体制备，放射配基，检测条件，分离结合与游离放射配基的方法，数测条件，分离结合与游离放射配基的方法，数据分析等实验内容。据分析等实验内容。 一、受体制备一、受体制备 1. .目的：受体制备是在放射配基结合实验前将含目的：受体制备是在放射配基结合实验前将含有某种受体的组织进

3、行预处理，使之更符合实有某种受体的组织进行预处理，使之更符合实验的要求。验的要求。2. .步骤步骤1）将组织或细胞在低渗缓冲液中匀浆。通常大）将组织或细胞在低渗缓冲液中匀浆。通常大部分受体在数小时是比较稳定的。但为了保持部分受体在数小时是比较稳定的。但为了保持活性，经常将组织尽快地放置在冰内。纤维组活性，经常将组织尽快地放置在冰内。纤维组织，例如肺，应该用尼龙网（织，例如肺，应该用尼龙网（50m50m）加以）加以过滤。过滤。2）慢速离心（）慢速离心（500g500g）可帮助除去组织中某些不）可帮助除去组织中某些不需要的部分需要的部分( (细胞核及大碎片细胞核及大碎片) ) 。 3）将匀浆在尽可

4、能快的转速下离心）将匀浆在尽可能快的转速下离心5-10min5-10min，但，但不要用超速（即不要用超速（即50,000g50,000g）。尽管对于很多受体）。尽管对于很多受体并不需要低温，但离心常规是在并不需要低温，但离心常规是在4 4下进行。下进行。4）将沉淀用相同缓冲液再度匀浆和离心。最终的）将沉淀用相同缓冲液再度匀浆和离心。最终的组织制备被称为粗微粒部分或膜部分。组织制备被称为粗微粒部分或膜部分。5）两步离心的目的是去除任何可溶性干扰物，如）两步离心的目的是去除任何可溶性干扰物，如内源性的神经递质、鸟嘌呤核苷酸等，它们可内源性的神经递质、鸟嘌呤核苷酸等，它们可能干扰放射配基结合测定。

5、能干扰放射配基结合测定。 3.注意事项注意事项1）匀浆缓冲液）匀浆缓冲液 匀浆缓冲液的选择通常不是关键，对于大匀浆缓冲液的选择通常不是关键，对于大部分受体制备，在中性部分受体制备，在中性pH下的任何缓冲液已经下的任何缓冲液已经足够。对于某些受体推荐在匀浆缓冲液和足够。对于某些受体推荐在匀浆缓冲液和/或温或温孵液中加入孵液中加入EDTA，以完全去除各种内源性物质。，以完全去除各种内源性物质。 质质 2）受体制备的贮存）受体制备的贮存 大部分在冷冻下是稳定的，原组织或膜部大部分在冷冻下是稳定的，原组织或膜部分均能贮藏在分均能贮藏在-20或或-80一段时间。某些受一段时间。某些受体和小块组织（体和小

6、块组织（10mg）储存后效果不好，应该）储存后效果不好，应该用新鲜组织进行测定。用新鲜组织进行测定。 二、放射配基二、放射配基 对于任何受体系统，商业上可提供若干种对于任何受体系统，商业上可提供若干种放射配基，要根据放射配基的特征和要解决的放射配基，要根据放射配基的特征和要解决的问题加以选择。应考虑的问题包括：放射性同问题加以选择。应考虑的问题包括：放射性同位素的种类（通常是位素的种类（通常是3 3H H或或125125I I），非特异结合），非特异结合的程度，放射配基对受体的选择性和亲和力以的程度，放射配基对受体的选择性和亲和力以及放射配基是激动剂还是拮抗剂等。及放射配基是激动剂还是拮抗剂等

7、。 1.放射配基的种类放射配基的种类 3H放射配基的优点是在化学上较稳定，生物学放射配基的优点是在化学上较稳定，生物学上与非标记的化合物没有差异，有较长的半衰期上与非标记的化合物没有差异，有较长的半衰期（12年），标记配基经常使用数月或更长时间，年），标记配基经常使用数月或更长时间，但它的特异活性较低（但它的特异活性较低（30-100Ci/mmol）。）。 而而125I的半衰期短（的半衰期短（60天），它的放射配基通天），它的放射配基通常每常每4-6周购买和准备一次。碘标放射配基的优点周购买和准备一次。碘标放射配基的优点是比较高的特异活性（是比较高的特异活性（2,200 Ci/mmol），在受

8、体），在受体密度低和组织数量少时特别有用。使用碘标配基密度低和组织数量少时特别有用。使用碘标配基不需要闪烁液，免除了购买闪烁液的费用和操作不需要闪烁液，免除了购买闪烁液的费用和操作步骤，因而方便和价廉。步骤，因而方便和价廉。 2.放射配基的亲和力放射配基的亲和力 放射配基与受体亲和力越高越好，因为测定中放射配基与受体亲和力越高越好，因为测定中可以使用较低浓度的放射配基，且非特异结合的水可以使用较低浓度的放射配基，且非特异结合的水平也较低。另外，亲和力越高，解离速率越慢，操平也较低。另外，亲和力越高，解离速率越慢，操作较方便。作较方便。 3.放射配基的稀释放射配基的稀释 有时，为了将一个测定管的

9、特异活性的最有时，为了将一个测定管的特异活性的最大值限制在大值限制在106计数计数/min（cpm），可以用非标），可以用非标记配基稀释记配基稀释125I放射配基，从而降低其特异活性。放射配基，从而降低其特异活性。另外，非标记配基应该使用非活性的含碘配基，另外，非标记配基应该使用非活性的含碘配基，而不是非碘的配基，因为后者与放射配基在化而不是非碘的配基，因为后者与放射配基在化学上是不同的，可能有不同的药理学特征。学上是不同的，可能有不同的药理学特征。 4.放射配基的总结合放射配基的总结合 通常放射配基的非特异结合越低越好。一通常放射配基的非特异结合越低越好。一个测定中如果个测定中如果50%总结

10、合是特异的，它被认为总结合是特异的，它被认为是合格的；是合格的；70%是好的，是好的，90%是非常好的。是非常好的。 三、温孵条件三、温孵条件 1.时间和温度时间和温度 对于饱和和竞争结合，所用的模型是平衡实验。温孵对于饱和和竞争结合，所用的模型是平衡实验。温孵的时间要足够长，以保证达到平衡（或至少是稳态）。的时间要足够长，以保证达到平衡（或至少是稳态）。 由于达到稳态的时间依赖放射配基的浓度，在预测温孵由于达到稳态的时间依赖放射配基的浓度，在预测温孵时间时，应使用低浓度的放射配基。室温下，使用接近它们时间时，应使用低浓度的放射配基。室温下，使用接近它们Kd的浓度，的浓度，20-60min可达

11、到稳态。如果在可达到稳态。如果在20和和60min之间结之间结合是恒定的，那麽可选定温孵时间为合是恒定的，那麽可选定温孵时间为30min。 尽管有人认为生理温度（尽管有人认为生理温度（37）更好，但实际上在室温）更好，但实际上在室温下（下（22）测定最为方便。另外，某些测定选在冰中（）测定最为方便。另外，某些测定选在冰中（4）进行，因为在这个温度下的数据重复性较好。进行，因为在这个温度下的数据重复性较好。 2.缓冲液缓冲液 通常缓冲液通常缓冲液pH在生理范围，即在生理范围，即pH7和和8之间。之间。实验中经常使用实验中经常使用Tris作为缓冲液，主要原因是使作为缓冲液，主要原因是使用方便，因为

12、商品用方便，因为商品Tris是预先配制好的，不需要是预先配制好的，不需要调整调整pH。但。但Tris不一定是最好的，可试用其它不一定是最好的，可试用其它的缓冲液。的缓冲液。 3.放射配基的浓度放射配基的浓度 在测定中，放射配基采用的浓度要依据实验的类型。在测定中，放射配基采用的浓度要依据实验的类型。对于动力学实验，浓度应较低，只要保证测定计数（例对于动力学实验，浓度应较低，只要保证测定计数（例如如300cpm）即可，大约为）即可，大约为0.2Kd较好。对于竞争实较好。对于竞争实验，使用相似的浓度，约为验，使用相似的浓度，约为Kd或更低一些。对于饱和实或更低一些。对于饱和实验，如果可能，放射配基

13、浓度范围应该是验，如果可能，放射配基浓度范围应该是0.1Kd10Kd。如果放射配基与一个以上受体位点结合，对高。如果放射配基与一个以上受体位点结合，对高亲和力位点（低亲和力位点（低Kd）应采用）应采用0.1Kd，对低亲和力位点，对低亲和力位点（高（高Kd）应采用）应采用10Kd。 4.受体浓度受体浓度 在合理的范围内，组织（受体）浓度越高，结合在合理的范围内，组织（受体）浓度越高，结合越好。增加受体浓度将增加特异结合对非特异结合的比越好。增加受体浓度将增加特异结合对非特异结合的比率，因为非特异结合中的大部分是与玻璃纤维滤膜的结率，因为非特异结合中的大部分是与玻璃纤维滤膜的结合。合。 粗略地看，

14、如果加入的放射配基有粗略地看，如果加入的放射配基有10%被结合，被结合，那麽组织的浓度就太高了。那麽组织的浓度就太高了。 另外，特异结合的量与组织浓度应该呈线性关系。另外，特异结合的量与组织浓度应该呈线性关系。对于大部分受体测定实验，一般采用的组织浓度范围是对于大部分受体测定实验，一般采用的组织浓度范围是2-10mg/ml湿重组织，或者湿重组织，或者100-500g/ml膜蛋白。对于膜蛋白。对于转染细胞，它们的受体是过表达的，测定采用的蛋白浓转染细胞，它们的受体是过表达的，测定采用的蛋白浓度应该大大降低。度应该大大降低。 5.非放射活性药物的浓度非放射活性药物的浓度 如果竞争性药物抑制放射配基

15、结合是按照如果竞争性药物抑制放射配基结合是按照单一位点模型，那麽大约单一位点模型，那麽大约10倍抑制剂浓度是足倍抑制剂浓度是足够的。如果涉及多位点结合或亲和力状态，那够的。如果涉及多位点结合或亲和力状态，那麽至少需要麽至少需要20倍浓度，跨越更大范围。倍浓度，跨越更大范围。 6.确定特异性结合确定特异性结合1）特异性结合和非特异性结合）特异性结合和非特异性结合 在所有放射配基结合测定中最重要的是确定特异性结合。在所有放射配基结合测定中最重要的是确定特异性结合。 从概念上讲，特异性结合可以被定义为与受体的结合。非特异从概念上讲，特异性结合可以被定义为与受体的结合。非特异结合是除此以外其它的结合。

16、结合是除此以外其它的结合。 实际操作上讲，非特异结合是有适当的过量非标记药物存在实际操作上讲，非特异结合是有适当的过量非标记药物存在（例如：比（例如：比IC50高高100倍），受体被完全阻断时的结合。非特异结合倍），受体被完全阻断时的结合。非特异结合包括放射配基与其它受体位点、玻璃纤维滤膜的结合，组织的吸附包括放射配基与其它受体位点、玻璃纤维滤膜的结合，组织的吸附和溶解于膜脂类等。特异性结合是总结合与非特异结合的差值。和溶解于膜脂类等。特异性结合是总结合与非特异结合的差值。 特征上讲，非特异结合达到稳态比特异性结合要快，当放射配特征上讲，非特异结合达到稳态比特异性结合要快，当放射配基浓度增加时

17、不会饱和。基浓度增加时不会饱和。 2）注意事项）注意事项 用于确定非特异结合的药物浓度不要太高，因为很高的药物浓度用于确定非特异结合的药物浓度不要太高，因为很高的药物浓度也可能抑制非特异结合。也可能抑制非特异结合。 确定非特异结合的一个好方法是用不同的非标记配基进行抑制实确定非特异结合的一个好方法是用不同的非标记配基进行抑制实验。在比验。在比IC50高高100倍浓度下，它们对结合的抑制程度应该是相同的。倍浓度下，它们对结合的抑制程度应该是相同的。 在测定非特异结合时，最好用与放射配基化学上不相似的药物。在测定非特异结合时，最好用与放射配基化学上不相似的药物。这是因为相似药物可能抑制与放射配基同

18、样这是因为相似药物可能抑制与放射配基同样“特异的特异的”结合，但并不结合，但并不是受体的结合位点。如果可能，应避免使用放射配基的非放射活性形是受体的结合位点。如果可能，应避免使用放射配基的非放射活性形式。有很多例子表明，在确定非特异结合时，由于未很好选择药物或式。有很多例子表明，在确定非特异结合时，由于未很好选择药物或浓度，导致错误的数据和结论。浓度，导致错误的数据和结论。放射配基的总结合、非特异性结合和特异性结合。放射配基的总结合、非特异性结合和特异性结合。 四、四、 结合与游离放射配基的分离结合与游离放射配基的分离 受体结合测定的一个关键步骤是分离结合受体结合测定的一个关键步骤是分离结合与

19、游离放射配基。在进行分离时，防止受体与游离放射配基。在进行分离时，防止受体-放放射配基复合物的解离是很重要的。射配基复合物的解离是很重要的。 降低温度可以减慢解离的速率，快速操作降低温度可以减慢解离的速率，快速操作可以缩短解离的时间。可以缩短解离的时间。 对于膜结合测定经常使用的技术是玻璃纤维滤膜对于膜结合测定经常使用的技术是玻璃纤维滤膜的真空过滤。通过过滤将含有放射配基的真空过滤。通过过滤将含有放射配基-受体复合物的膜受体复合物的膜碎片留在滤膜上，游离的（未结合的）放射配基与滤液碎片留在滤膜上，游离的（未结合的）放射配基与滤液一起穿过滤膜被弃去。一起穿过滤膜被弃去。 用大量的缓冲液洗涤膜碎片

20、和滤膜可降低非特异结用大量的缓冲液洗涤膜碎片和滤膜可降低非特异结合。另外，预先将滤膜用某种溶液（如合。另外，预先将滤膜用某种溶液（如0.1%聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺水溶液）洗涤或浸泡一段时间，也可减少滤膜上的非特水溶液）洗涤或浸泡一段时间，也可减少滤膜上的非特异结合。在某些测定中，选择滤膜的材料也是很重要的。异结合。在某些测定中，选择滤膜的材料也是很重要的。 过滤法的优点是快速和方便。缺点是只有在放射配过滤法的优点是快速和方便。缺点是只有在放射配基基-受体复合物的亲和力高于受体复合物的亲和力高于10nM时才能应用。它的时才能应用。它的主要非特异结合是与滤膜而不是与组织制备的结合。主要非特异结合是与

21、滤膜而不是与组织制备的结合。对于放射配基与受体的亲和力在对于放射配基与受体的亲和力在10nM-1M范围（这范围（这时解离可能太快）的测定，以及与滤膜的非特异结合时解离可能太快）的测定，以及与滤膜的非特异结合高得不能应用时，经常使用离心技术来代替过滤。高得不能应用时，经常使用离心技术来代替过滤。五、配体结合试验类型和结果分析五、配体结合试验类型和结果分析 （一）饱和曲线（一）饱和曲线 用一固定浓度的受体蛋白和不同浓度的放射配体用一固定浓度的受体蛋白和不同浓度的放射配体一起孵育，将特异性结合与配体浓度作图，可画出一一起孵育，将特异性结合与配体浓度作图，可画出一矩形抛物线即饱和曲线。矩形抛物线即饱和

22、曲线。放射配基受体结合的饱和曲线放射配基受体结合的饱和曲线 1. ClarkClark模型：模型： 配体受体结合反应为可逆双分子反应（配体受体结合反应为可逆双分子反应（L+RLRL+RLR）；所有受体都）；所有受体都是等效和独立的；配体本身不代谢，也不与其它位置结合；生物效是等效和独立的；配体本身不代谢，也不与其它位置结合；生物效应正比于结合受体数目。应正比于结合受体数目。根据质量作用定律：根据质量作用定律：平衡时（平衡时（LT）(RL) (LT)(L) RLRLLRLRRLLRTT)()(KD （1） 故故 KD= RLLRLRT（2） (LT)总配体浓度；（总配体浓度；（L）游离配体浓度；

23、（）游离配体浓度；（RL）结合配体浓度；）结合配体浓度； (RT)总受体浓度，即最大结合；总受体浓度，即最大结合；KD平衡解离常数；平衡解离常数；KA亲和常亲和常数数 KA= 1/KD2.Scatchard作图：作图：（2）式变换）式变换 DDTKRLKRLRL（3） LRL用用对（对（RL）作图，可得直线，其斜率为）作图，可得直线，其斜率为 DK1，横轴截距横轴截距为（为（RT）。）。 饱和实验的饱和实验的Scatchard作图作图 3.Hill作图：作图：当配体受体结合反应不是简单的双分子反应时，当配体受体结合反应不是简单的双分子反应时， R+nL=RLn根据质量作用定律根据质量作用定律 nDnTLKLRRL经变换有经变换有 log( RLRRLT)=nlog(L)-log(kD) n为大于为大于1的整数时，结合过程是的整数时，结合过程是n+1个分子反应。个分子反应。n不是整数时不是整数时 n1,正协同作用；正协同作用；n1，负协同作用，负协同作用协同是一种现象，指配体与受体部位结合后，可影响与另一受协同是一种现象，指配体与受体部位结