第3章基因工程的酶学基础(植物基因工程)

1、第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第二节第二节 DNA 连接酶连接酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNA分子中分子中的某种的某种特定核苷酸序列，特定核苷酸序列，并由此处并由此处或附近或附近切割切割DNA双链双链的核酸的核酸内切内切酶酶。（Restriction endonuclease）相邻的两个核苷酸残相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键基之间的磷酸二脂键 2. 性质性质内切酶。内切酶。原核生物，少数霉菌和蓝藻。原核生物，少数

2、霉菌和蓝藻。即在核酸分子链的即在核酸分子链的制造切口的酶。制造切口的酶。自我保护作用。自我保护作用。3. 功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/M体系）体系）1. 来源来源限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外外源源DNA切成小片断。切成小片断。（1）限制（）限制（Restriction）细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化修饰所保护，甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（）修饰（Modification） Dam甲基化酶甲基化酶GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引

3、入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列序列在第二个在第二个C上上C5位置上位置上引入甲基引入甲基I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型II 型型限制性内切酶限制性内切酶 III型型限制性内切酶限制性内切酶 1、内切酶和甲基化作用是分开的2、内切序列特异性首先由首先由M. Meselson和和R. Yuan在在1968年从年从大肠杆菌大肠杆菌 B株株和和 K株株分离的。分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(

4、N)6GTGC1. I型限制性内切酶型限制性内切酶 如如 EcoB和和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何一种核苷酸需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）腺苷蛋氨酸）（3）作用条件）作用条件在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点）切割位点首先由首先由H.O. Smith和和K.W. Wilcox在在1970年从流感嗜血菌中分离出来。年从流感嗜血菌中分离出来。 （1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链

5、双链DNA上的特殊靶序上的特殊靶序列（多数是回文序列）。列（多数是回文序列）。 与与DNA的来源无关的来源无关2. II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind 回文结构：回文结构：指的是反向重复的一段DNA序列，其特点有二：1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5/ 3/），其核苷酸顺序相同（2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。（3）粘性末端（）粘性末端（stick

6、y ends，cohensive ends）含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型： 5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如Pst I切点）切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 1、 同裂酶同裂酶（Isoschizomers)：来源不：来源不同，同，识别位点的识别位点的的限制性内切酶。的限制性内切酶。 （4）II型限制酶的一些特殊性质型限制酶的一些特殊性质 完全同裂酶：完全同裂酶：

7、 识别位点和切点完全相同识别位点和切点完全相同。 如如Hind 和和Hsu I。识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。 如如Xma I 和和 Sma I。 不完全同裂酶：不完全同裂酶：一种识别简并序列的限制酶具有另一种限制一种识别简并序列的限制酶具有另一种限制酶的功能，酶的功能，如如EcoR I 和和 Apo I。 “ “同功多位同功多位”识别的识别的，但能切出，但能切出的粘性末的粘性末端。如端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等等 2、同尾酶、同尾酶(Isocaudarners） Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点

8、，位点，不能不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？Sau 3A3. III类限制性内切酶类限制性内切酶 切割切割DNA位点位点 与识别位点不同。与识别位点不同。反应需要反应需要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺腺苷蛋氨酸）。苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。II类内切酶类内切酶内切酶和甲内切酶和甲基化酶分开基化酶分开单一成分单一成分Mg2+ 回文序列回文序列 （IIs型除外）型除外）切割位点切割位点在距离识别位在距离识别位点至少点至少1000 bp处随机切处随机切开一条单链。开一条单链。位于寄主位于寄主特异性位特异性位点或其附点或其附近近距寄主特异距寄主特异

9、性位点性位点3端端2426bp处处DNA易位作用易位作用能能不能不能不能不能甲基化作用的位甲基化作用的位点点寄主特异性位寄主特异性位点点寄主特异寄主特异性位点性位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的识别未甲基化的序列进行切割序列进行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割 不是不是是是是是基因工程中的用基因工程中的用途途无用无用十分有用十分有用无用无用u 前3个字母。属种名。u 大写字母。菌株类型。u 罗马字。第几种酶。u 同属不同种，前2个字母相同时，取第三个字母。EcoR IEscherichia coli发现顺序序号发现顺序序号Hind IIIHaemophilus infl

10、uenzae三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名u 4碱基识别的限制酶为：44=256u 5碱基识别的限制酶为：45=1024u 6碱基识别的限制酶为：46=4096u 7碱基识别的限制酶为：47=16384u 8碱基识别的限制酶为：48=65536四、限制性内切酶的切割频率四、限制性内切酶的切割频率DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。 1. DNA的纯度的纯度 五、影响限制性内切酶活性的因素五、影响限制性内切酶活性的因素纯化纯化DNA 加大酶的用量加大酶的用量延长反应时间延长反应时间 扩大反

11、应体积，使潜在的抑制因素被相应的扩大反应体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释（稀释（ 20 l）一般采取一般采取大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2. DNA的甲基化程度的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCAGG/CCTGG的的C）基因工程中必须使用甲基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。基化酶失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 oC，少数要求，少数要求40-65 oC。3. 温度温度 是影响限制酶活性的重要

12、因素。是影响限制酶活性的重要因素。4. 缓冲液缓冲液(Buffer) 缓冲液的化学组成缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+ +和离子强度；和离子强度； Tris-HCl： 维持维持pH； 二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、一定的温度、离子强度、pH等条件下才等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。表现最

13、佳切割能力和位点的专一性。 限制酶的活性限制酶的活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（和切割效率，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号星号（*）活性）活性EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！概括起来，诱发星活性的因素有如下几种概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1) 高甘油含量(5, vv

14、)；(2) 限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)；(3) 低离子强度(25 mmolL)；(4) 高pH(80以上)；(5) 含有有机溶剂，如DMSO(二甲基亚砜 )，乙醇等；(6) 有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等)。5. 酶对消化效率的影响酶对消化效率的影响 但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（1g加25U酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量 ？酶过量对酶切反应的影响：酶过量对酶切反应的影响：1）、酶过量（一般为100U/gDNA）会影响识别序列的正确性，如：BamHI 的正常识别序列: GGATTC ;酶过量识别

15、序列 NGATCN2)、酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。六、限制性内切酶对六、限制性内切酶对DNA的消化的消化1. 内切酶与识别序列的结合模式内切酶与识别序列的结合模式 1986年年J.A. McClarin等通过等通过X射线晶体衍射发现射线晶体衍射发现II类类限制酶是以限制酶是以同型二聚体同型二聚体的形式与靶序列结合。的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG内切酶在内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都被切识别位点都被切开。开。2. 完全消化完全消化 12 341234只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温

16、时间、降低反应温度或减通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。少酶的用量可达到局部消化的目的。3. 局部消化局部消化 12 3414大多数酶可用大多数酶可用65 oC温育温育5分钟失活。分钟失活。 或用或用上样缓冲液失活上样缓冲液失活。4. 限制酶酶切反应的终止限制酶酶切反应的终止 5. 几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点酶切反应举例酶切反应举例 20 L 10 X buffer 2 10 X BSA 2 ddH2O 11 DNA 2 EcoR I(20u / L) 1 Kpn I (10 u / L) 2 20 L37 C2hr1、电泳孔清晰可见，、电泳孔

17、清晰可见，孔内无杂质。孔内无杂质。2、条带明亮、均匀、条带明亮、均匀、平直，宽度适中。平直，宽度适中。3、背景低，但不可过、背景低，但不可过黑。黑。4、无杂点。、无杂点。5、泳道无漂移。、泳道无漂移。6、DNA Ladder范围合范围合适，亮度适中。适，亮度适中。从细菌从细菌DNA环化现象推测，必定存在一环化现象推测，必定存在一种能把两条种能把两条DNA双链连接到一起的酶。双链连接到一起的酶。第二节第二节 DNA 连接酶连接酶一、一、DNA连接酶（连接酶（ligase)的发现的发现1967几个实验室同时发现能够在几个实验室同时发现能够在2条条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶链之间形成磷酸二酯键的

18、酶（1）大肠杆菌连接酶（）大肠杆菌连接酶（E.coli DNA)1. 几几种种DNA连接酶连接酶该酶由大肠杆菌基因组中的该酶由大肠杆菌基因组中的lig基因编码，基因编码，只能连接只能连接粘性末端粘性末端。二、二、DNA ligase的特点的特点（2）T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶该酶是从该酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分噬菌体感染的大肠杆菌中分离的，由离的，由DNA30编码的产物。不但能连编码的产物。不但能连接粘性末端，接粘性末端， 还能连接还能连接齐平末端齐平末端。（3）Taq DNA连接酶连接酶该酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，该酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一同

19、时必须与另一DNA链形成杂交体，相当链形成杂交体，相当于连接双链于连接双链DNA中的缺口。中的缺口。（4）T4 RNA连接酶连接酶该酶可催化单链该酶可催化单链DNA或或RNA与另一单链与另一单链DNA或或RNA之间的连接。之间的连接。（1）DNA3端有游离的端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。（2）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中： NAD+ +2. 连接条件连接条件1. ATP（NAD+ +)提供激活的提供激活的AMP。三、连接反应的机理三、连接反应的机理2. ATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶

20、-AMP （AMP与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸 -氨基氨基相连相连）”复合物，并复合物，并释放出焦磷酸释放出焦磷酸PPi。3. 连接酶连接酶-AMP 复合物同复合物同3OH和和5P基团的基团的缺口结合，缺口结合，AMP同磷酸基团反应，并使其同同磷酸基团反应，并使其同3OH基团接触，产生一个新的磷酸二酯键，基团接触，产生一个新的磷酸二酯键，从而使缺口封闭。从而使缺口封闭。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ + +H3NAMPATPPPi 3.1 AMP随后从连接酶的赖氨酸随后从连接酶的赖氨酸 -氨氨基转移到基转移到DNA一条链的一条链的5端端P上，形上，形成成“DNA-腺苷酸

21、腺苷酸”复合物。复合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP3.2. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出成磷酸二脂键，释放出AMP。连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37 C。四、连接反应的温度四、连接反应的温度1. 最佳温度最佳温度但在但在37下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2. 实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 C。增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1. 插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度反应温度

22、五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素1020倍。倍。一般一般14163. 连接酶的浓度连接酶的浓度在平末端DNA的连接反应中,最适的反应酶用量为12U,而黏性末端仅为0.1U便能达到连接的最佳效果.4. 连接反应的时间连接反应的时间当连接温度在1216 之间时之间时,连接反应时间在连接反应时间在116小时之间小时之间.如果温度更低如果温度更低,则延长反应时间则延长反应时间.?由限制性内切酶创造的黏性末端的连接属于分分子内部的连接子内部的连接,而平齐末端的连接则属于分子之分子之间的连接间的连接,因此后者反应速度相对慢得很多,如何提高其连接效率呢?1、加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接

23、）2、加大平齐末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会3、加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用4、加入单价阳离子（Nacl )，最终浓度150200 mM5、将平齐末端变成黏性末端第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶聚合酶 4. T4 DNA聚合酶聚合酶 5. 修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 6. 逆转录酶逆转录酶1. 共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端端。2. 主要区别主要区别T7 D

24、NA聚合酶可以聚合酶可以连续添加数千个连续添加数千个dNTPs而而不从模板上掉下来。不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续聚合酶只能连续添加添加10多个多个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。二、常用的二、常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。高高3. 常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较三、三、DNA聚合酶在基因工程中的用途聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚

25、合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的端的部分。就成为部分。就成为Klenow fragment。 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ + 带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应条件）的反应条件-OH5 3 dNTPs可以是单链的，也可以是双链的标记标记核酸探针：能够同某种被研究的核核酸探针：能够同某种被研究的核酸序列特异性互补结合的，带有标酸序列特异性互补结合的，带有标记的核酸分子。记的核酸分子。（3）DNA聚合酶聚

26、合酶I的用途的用途已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 切口平移法：切口平移法：53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一个核苷端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段上一段DNA的的3一侧补上一个一侧补上一个新的核苷酸。新的核苷酸。切口切口切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 随机引物法具有具有53聚合酶活性和聚合酶

27、活性和35外切酶活外切酶活性。（性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性质的性质DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 3端补平端补平5 5 klenow补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途）主要用途3隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内

28、切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I -32P-dATP -32P-dGTP25oC 1hmRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物（1） T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质3. T4 DNA聚合酶聚合酶从从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由中分离纯化。由噬菌体基因噬菌体基因43编码。编码。有有5

29、3聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性（降解单链更快）。性（降解单链更快）。 来源来源 酶活性酶活性当没有当没有dNTP时，时，T4DNA聚合酶行使聚合酶行使35外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出3隐蔽端。隐蔽端。如果只有一种如果只有一种dNTP，则降解到该，则降解到该dNTP的位置。的位置。5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5 （2） T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途标记末端（取代合成法）标记末端（取代合成法）用用35外切酶活性作用于外切酶活性作用于所有末端形式所有末端形式的的3端端（平端、（平端、

30、3隐蔽端、隐蔽端、5隐蔽端）制隐蔽端）制造出造出3隐蔽端。隐蔽端。 再利用它的再利用它的53聚合酶活性补平，并加聚合酶活性补平，并加入放射性标记的入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端补平隐蔽末端 DNA 3末端标记末端标记酶切中间酶切中间产生两个产生两个末端标记末端标记加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶 （35外切）外切）DNA酶切片断酶切片断T4 DNA聚合酶聚合酶 （53聚合）聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶切内切酶切无无dNTPsa. 放射性标记的放射性标记的优缺点优缺点：制作简单、制作简单

31、、 高比放射性、高比放射性、 放射自显影效果好。放射自显影效果好。优点：优点：缺点：缺点：半衰期短（半衰期短（32P只有只有14.3天）、天）、 不易保存、不易保存、 对人体有害。对人体有害。 要求在专门实验室操作。要求在专门实验室操作。i）生物素标记：）生物素标记：生物素（生物素（biotin），又称维生素），又称维生素H、辅酶、辅酶R可以与可以与dNTP酰化结合成为生物素酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素生物素-1,4-dATP、生物素、生物素-1,1-dUTP等。等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（也可以被生物素连接酶（biot

32、in ligase）催化与蛋白质共价结合。催化与蛋白质共价结合。纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制制造单链缺口造单链缺口DNA Pol I 进行进行缺口转移缺口转移生物素生物素-dTTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 生物素生物素-dTTP生物素生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中探针中抗生物素蛋白（抗生物素蛋白（avidin）：）：链霉抗生物素蛋白（链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：）：生物素的识别生物素的识别亲和素亲和素：是一种是一种鸡鸡卵清蛋白。卵清蛋白。细菌细菌中中avid

33、in的类似物。的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：ii）地高辛标记：）地高辛标记：可以与可以与dNTP连接成地高辛连接成地高辛-dUTP等，参等，参入入DNA合成过程。形成地高辛标记的合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒的试剂盒 (kit)。地高辛的结合物是地高辛的结合物是抗地高辛抗体抗地高辛抗体。地高辛是一种从毛地黄属植物中提取的强地高辛是一种从毛地黄属植物中提取的强心苷，被广泛用于治疗心脏病。心苷，被广泛用于治疗心脏病。4. T7 DNA聚合酶聚合酶（1）来

34、源）来源从从T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞中纯噬菌体感染的大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：化出来的，由两个亚基组成： T7T7基因基因5 5编码的大亚基：编码的大亚基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。硫氧还蛋白。 增加大亚基对增加大亚基对模板的亲和性模板的亲和性。（2）T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 持续合成能力强持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。互补链。 35外切酶活性高外切酶活性高单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。 不受不受DNADNA二级结构的

35、影响二级结构的影响其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍二级结构的阻碍 进行末端标记进行末端标记 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成为模板的合成如如M13 补平隐蔽末端补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途取代合成法标记取代合成法标记3末端。末端。与与T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成补平补平3隐蔽末端；隐蔽末端； 水解水解修平修平3突出末端。突出末端。5. 修饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚聚合能力和聚合速率提高了合能力和聚合速率提高了3倍。倍。（2

36、）修饰后的）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA测序测序双脱氧法。双脱氧法。 标记标记DNA 3隐蔽末端隐蔽末端 更有效地补平末端更有效地补平末端6. 逆转录酶逆转录酶最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母鸟类骨髓母细胞瘤病毒细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：）：依赖依赖RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指指导的导的DNA聚合酶）。聚合酶）。（1）来源）来源RNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。（2）AMV的性质的性质由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。 链链有反转录活性和有反转录活性和 RNaseH活性。活性。RNase

37、H： 链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以以53或或35方向特异地水解方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链链。RNaseHRNA DNARNA DNA（3）逆转录酶的用途）逆转录酶的用途 链链RNA-DNA杂交双链中杂交双链中53DNA外外切酶活性。切酶活性。 合成合成cDNA以以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA 合成合成DNA探针探针用随机引物（用随机引物（random primer）或）或oligo dT做引物。做引物。随机

38、引物：随机引物：随机顺序形成的寡聚随机顺序形成的寡聚DNA片断。片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）（理论上它能与各种序列的模板结合） RT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转录反转录出出cDNA第一链。第一链。高高遗传修饰遗传修饰T7DNAT7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高3. 常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1. 来源来源小牛胸腺纯化出的一种小分子量的碱性蛋白质。小牛胸腺纯化出的一种小分子量的碱性蛋白质。2. 组成组成大小两个亚基。大小两个亚基。3.

39、 特性特性 53DNA聚合酶活性聚合酶活性(逐个地将脱氧核逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性苷酸分子加到线性DNA分子分子3-OH末端末端)（terminal transferase） 不需要模板不需要模板！ 需要需要3OH、二甲胂酸缓冲液。、二甲胂酸缓冲液。 底物可以是单链底物可以是单链DNA、 是是3端端突出的双链突出的双链DNA、 平末端平末端在在Co2+ +代替代替Mg2+ +下也可以。下也可以。 随机添加的随机添加的dNTPs。 如果只有一种如果只有一种dNTP，就添加上，就添加上同聚物同聚物。DNA 5 3 TTTdTTP ，末端转移酶，末端转移酶4. 末端转移酶的用途末端转移酶的用途

40、（1）同聚物加尾）同聚物加尾给给外源外源DNA片断片断和和载体载体分子分别加上互补分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源外源DNADNA载体载体DNADNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶末端转移酶（2）再生酶切位点）再生酶切位点克隆片断。克隆片断。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切酶切A TTCGAAGCTT AKlenow补平补平AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA末端转移酶末端转移酶dTTPAAAAAA外源外源DNAAAGCTT

41、TT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位点位点Hind位点位点连接连接1. 碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌碱性磷酸酶）细菌碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。具有抗热性。SDS中加热中加热68oC可完全失活。可完全失活。2. 碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的特性催化脱掉催化脱掉DNA（或（或RNA）5端的磷酸

42、端的磷酸根。根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3 HO-OH碱性磷酸酶碱性磷酸酶3. 碱性磷酸酶的功能碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接）防止线性化的载体份子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTT TTCGAAHind酶切酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 5 5 A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH与与OH不能形成磷酸二酯键，所以不不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。能自我连接。但同一酶切后的但同一酶切后的外源外源DNA的的5端有

43、端有P，能与脱磷酸的载体能与脱磷酸的载体OH连接。连接。三、三、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1. 来源来源T4噬菌体的噬菌体的pseT基因编码。基因编码。 从从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能功能T4多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸激酶催化ATP的的-磷酸基团磷酸基团移到多聚核苷酸的移到多聚核苷酸的5末端单核苷酸上。末端单核苷酸上。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP多核苷酸激酶多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 碱性磷酸酶碱性磷

44、酸酶第五节第五节 核酸外切酶（核酸外切酶（ Exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始催化是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解降解核苷酸的酶。核苷酸的酶。一、单链一、单链DNA外切酶外切酶1. 大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）53外切外切识别识别5-OH2. 大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶（exo ）53、35外切外切识别识别3-OH、5-P二、双链二、双链DNA外切酶外切酶1. 核酸外切酶核酸外切酶（exo exo ）35外切外切识别识别3-OH主要用途：主要用途：在在DNA双链的末端产生出单链区域。双链的末端产生出单链区域。5 5 5 5 exo 与与klenow配合进行配合进行3端标记端标记-OHHO-2. 核酸外切酶（核酸外切酶（ exo）53外切。外切。主要用途：主要用途：使使DNA双链变成单链（短）。双链变成单链（短）。5 P-P 5 5 5 exo 成为测序模板。成为测序模板。识别识别5-P（但不能降解（但不能降解5-OH）虽然也能切割单链虽然也能切割单链DNA,但效率仅为双链的但效率仅为双链的1/200.不能切割带切口或缺口的不能切割带切口或缺口的DNA.3. T7基因基因6核酸外切酶核酸外切酶 53外切。外切。用途与用途与 exo一样。一样。既能识别既能识