生物信息学在高通量测序数据分析中的应用

1、生物信息学在高通量测序生物信息学在高通量测序数据分析中的应用数据分析中的应用主 讲 人：李广林高通量测序技术的介绍高通量测序技术的介绍高通量测序技术的主要应用高通量测序技术的主要应用生物信息学在高通量测序数据中的主要应用生物信息学在高通量测序数据中的主要应用高通量测序简介高通量测序简介w高通量高通量测序测序:一次性对一次性对几百万到十亿条几百万到十亿条DNA分子进行分子进行并行测序并行测序，又称为，又称为下一代测序技术下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深深度测序度测

2、序。 wHigh-throughput Sequencing wNext Generation Sequencing wDeep Sequencing3主要测序技术 w 第一代测序技术Sanger sequencing (1980s)w 第二代测序技术(next generation sequencing, NGS)w Roche/454 (2005)w Illumina/Solexa (2006)w Life/APGs SOLiD (2007)w Life/APGs Ion torrent (2010)w 第三代测序技术Pacific Biosciences single molecule

3、sequencing (2011)Nanopore sequencing测序的基本反应原理：DNA聚合反应第一代测序技术第一代测序技术 Sanger 法法结合荧光标记和毛细管电泳结合荧光标记和毛细管电泳测序峰图ABI 3730 sequencerw Read length: 1,000 bpw Accuracy: 99.999%w Cost: $0.5/kbw Throughput: 6x105 bp/daySanger vs NGS高通量测序技术Roche/454 pyrosequencing以固化了引物的玻璃微球为中心形成油包水结构的乳滴，每个乳以固化了引物的玻璃微球为中心形成油包水结构的

4、乳滴，每个乳滴都是一个滴都是一个PCR反应的微量反应器（通过控制测序文库反应的微量反应器（通过控制测序文库DNA的浓的浓度和微球悬浊液的浓度，保证大多数微球只结合一条度和微球悬浊液的浓度，保证大多数微球只结合一条DNA模板）。模板）。经过多轮循环反应，每个微球表面都结合了数千个相同的拷贝。经过多轮循环反应，每个微球表面都结合了数千个相同的拷贝。变性后，使微球上结合的都是单链变性后，使微球上结合的都是单链DNA片段。片段。富集微球，转移到刻有大规模微孔阵列的微孔板上，每个微孔只富集微球，转移到刻有大规模微孔阵列的微孔板上，每个微孔只容纳一个微球。容纳一个微球。高通量测序技术Roche/454 p

5、yrosequencing顺次向流通池中加入顺次向流通池中加入4种种dNTP中的一中的一种，流过微孔板的一面。种，流过微孔板的一面。当当dNTP与脱氧核糖骨架连接后释放出与脱氧核糖骨架连接后释放出焦磷酸，在与焦磷酸，在与dNTP一起加入的一起加入的ATP硫硫酰化酶和荧光素酶作用下产生一系列酰化酶和荧光素酶作用下产生一系列级联反应，放出不同的光信号。级联反应，放出不同的光信号。每个微孔中光信号的有无，就表明对每个微孔中光信号的有无，就表明对应的应的dNTP是否连接到了片段上。是否连接到了片段上。454测序的原理：焦磷酸测序! #$% % &( ) *) +,$% % &- ! !

6、 . /) . 012 0*! . 0,. 3. /) . 012 0* H3YHMSequencing by Synthesis ! #8+. +?S( ! X5 83. HM. 9+. /) . 0J 8G G 8098G M8+2 0,N. +8D. H39. 3?4% % J D. +LH38G 83*. X:a3) 05 813H+,N. 62 1HS2 ,. 36G 8,. 9. V2 1. 9) 32 0*8+. /) . 012 0*3) 0b ! ( 0) 1G . HJ 9. 1HD7G . D. 0,83,H,N. ,. D7G 8,. +,3809*. 0. 38,.

7、+8G 2 *N,+2 *08G b ! SN. G 2 *N,+2 *08G 2 +3. 1H39. 9=,N. ! ! ; 18D. 38b ! SN. +2 *08G +,3. 0*,N2 +73H7H3J H08G ,H,N. 0) D=. 3HL0) 1G . HJ 9. +2 01H37H38,. 9b 8.0 h 7.5 h 4.5 h and 10.5 h DNA library preparation and titration emPCR Sequencing Flowgram Key sequence 逐次加入逐次加入dATP等，每加入一种，检测信号，等，每加入一种，检测

8、信号，清洗再加下一种。清洗再加下一种。ATP硫酸化酶硫酸化酶5-磷酰硫酸磷酰硫酸荧光素酶荧光素酶高通量测序技术Roche/454 pyrosequencingw 优势：读长长(max 1 kb, GS FLX Titanium XL+)，运行时间短(10-23 hours)w 主要错误来源：难以准确判定连续碱基（经过3次级联化学反应产生的荧光信号与连接上碱基的数量线性关系较差），容易产生Indelw 劣势：通量相对偏低(max 700M)，单位成本高GS FLX+ SystemGS Junior System高通量测序技术Illumina/Solexa单链单链DNA两端加上非对称的通用接头两端

9、加上非对称的通用接头(包括测序引物包括测序引物)，接头，接头与事先固定在固相芯片表面的序列互补与事先固定在固相芯片表面的序列互补单链单链DNA结合到芯片表面形成桥式结构。然后使用接头引物结合到芯片表面形成桥式结构。然后使用接头引物进行进行PCR扩增扩增变性后在一个芯片上可以形成上亿个不相关的单链变性后在一个芯片上可以形成上亿个不相关的单链DNA分子分子簇，其一端固定在芯片表面，另一端是自由的簇，其一端固定在芯片表面，另一端是自由的高通量测序技术Illumina/Solexa使用测序引物从自由的通用接头一使用测序引物从自由的通用接头一侧开始测序反应。侧开始测序反应。测序使用的测序使用的dNTP每

10、种碱基被不同的每种碱基被不同的荧光基团标记，同时脱氧核糖的荧光基团标记，同时脱氧核糖的3-OH被封闭，这样每轮测序循环只能被封闭，这样每轮测序循环只能延伸一个核苷酸。读取碱基荧光信延伸一个核苷酸。读取碱基荧光信号，就能知道这一轮每个簇结合上号，就能知道这一轮每个簇结合上的是什么核苷酸的是什么核苷酸然后切除荧光基团，打开被封闭的然后切除荧光基团，打开被封闭的3-OH，继续进行下一轮反应，继续进行下一轮反应Solexa测序的原理：可逆阻断高通量测序技术Illumina/Solexaw优势：通量最高 (max 600Gb, HiSeq 2500)w主要错误来源：同一个簇内不同DNA链延伸情况不同（相

11、位差），导致读取错误w劣势：读长较短 (max 250bp, HiSeq 2500)，运行时间长(1-14 days，HiSeq 2500大幅提升了运行速度)，数据存储和分析难度大。MiSeqHiSeq 2000Genome Analyzer II高通量测序技术AB/SOLiDSOLiD System5500 seriesSOLiD 测序探针介绍类似类似454的微球反应体系，但使用连接反应。的微球反应体系，但使用连接反应。SOLiD Sequencing 每次测序反应的第每次测序反应的第1轮，测序引物轮，测序引物1与接头序列互补形成平末端，然后与探针与接头序列互补形成平末端，然后与探针连接。当

12、探针连接。当探针1,2位与待测序列模板互补并连接上之后，获取荧光信息。然位与待测序列模板互补并连接上之后，获取荧光信息。然后在探针的后在探针的5,6位之间切开探针，进行下一个连接反应。这样重复多次，可位之间切开探针，进行下一个连接反应。这样重复多次，可以获得模板序列的第以获得模板序列的第1-2, 6-7, 11-12位置的信息。位置的信息。高通量测序技术Life/APGs SOLiD优点：由于使用双碱基编码技术（two-base encoding），准确率最高，通量高 (max 300 Gb)缺点：读长最短 (max 75 bp)，运行时间长(7-10 day)，数据储存和分析难度大5500

13、Series Genetic Analysis Systems高通量测序技术Life/APGs Ion torrent PGM454发明者的新作品发明者的新作品测序反应在微阵列芯片上测序反应在微阵列芯片上的微反应池中进行。的微反应池中进行。每个每个dNTP结合到延伸链上，结合到延伸链上，会释放出一个会释放出一个H+，pH值变值变化会导致电位变化。化会导致电位变化。检测每次检测每次dNTP流过的电位流过的电位差变化，就能知道该差变化，就能知道该dNTP是否连接上去。是否连接上去。高通量测序技术Life/APGs Ion torrent PGMw 优点：速度快(5%）的单核苷酸变异w 群体SNP

14、callingA T C G A T C G A A T T C G T A C G A T G C T T A G C T A G C A T A C GReferenceReads A T C G A T C G C G T A C G A T G C T T A G C T A G C A T A C GShort InDel 检测检测寻找SV (structure variation)w Copy number variation (CNV)w 需要一定的测序覆盖度 (10 x)，mapping depth也需要仔细检查转录组转录组Small RNA降解组降解组TextRNADGE生物

15、信息学在生物信息学在RNA omics方面的应用方面的应用RNA高通量测序高通量测序转录组转录组Small RNA降解组降解组TextRNADGERNA测序转录组测序转录组测序简介 转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有来的所有RNA的总和，包括的总和，包括mRNA和非编码和非编码RNA(Non-coding RNA)。 第二代测序系统可精确检测单个碱基，并且第二代测序系统可精确检测单个碱基，并且不受到研究中先验信息的干扰，科研人员能够快不受到研究中先验信息的干扰，科研人员能够快速地获得某一物种特定器官或组织在某一状态下速地获得某一物种特定

16、器官或组织在某一状态下几乎所有几乎所有mRNA转录本序列，从而能够开展：转录本序列，从而能够开展：UTRs区域界定区域界定、可变剪切研究可变剪切研究、低丰度新转录本低丰度新转录本发现发现、融合基因鉴定融合基因鉴定、cSNP（编码序列单核苷酸（编码序列单核苷酸多态性）研究等。多态性）研究等。 转录组研究内容 转录组数据评估 基因表达注释 差异表达基因鉴定、聚类、Gene ontology 、KEGG pathway分析 基因结构优化 新转录本 可变剪接 融合基因 SNP转录组测序流程无参考序列测序流程无参考序列测序流程有参考序列测序流程有参考序列测序流程转录组主要分析内容基因融合分析基因嵌合分析

17、流程基因嵌合分析流程 MIPOL1-DGKB 基因融合模式基因融合模式 Genomic intergenic regionReadsclusterPaired Readsdistribution优化基因结构优化基因结构鉴定新的转录本鉴定新的转录本Paired-End (PE) ReadsReads 比对到参考序列基因间区域比对到参考序列基因间区域鉴定可变剪接（鉴定可变剪接（ Alternative Splicing ）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3common readsjunction readsmRNA分析分析RNA水平水平SNP转录组重测

18、序比对软件：转录组重测序比对软件：SOAPDe novo 转录组测序转录组测序: 组装软件：组装软件：SoapDenovo比对软件：比对软件： SoapSNP转录组转录组Small RNA降解组降解组TextRNADGERNA测序小RNA测序Small RNA:是长度在是长度在18-40nt的非编码的非编码RNA，在基，在基因表达调控中发挥着重要的作用。因表达调控中发挥着重要的作用。小小RNARNA的产生的产生总总RNA通过切胶回收通过切胶回收CATGGCTGAAGTCAAGGATGTCATGGAAGGCAATCCCACATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAAC

19、ATTTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGCTGAATCTGAGGCTCTCATGGCTGAATCTGAGGCTCTCATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGCTGAAGTCAAGGATGTCATGGCTGAAGTCAAGGATGT测序测序CATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACAT

20、TTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCT CATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATAmiRNAsiRNArepeatunann比对比对注释和预测注释和预测Small RNA测序Small RNA分析small RNA small RNA 的长度分布；

21、的长度分布；rRNArRNA、tRNAtRNA、snRNAsnRNA、snoRNAsnoRNA、miRNAmiRNA、piRNApiRNA、siRNAsiRNA的注释；的注释；物种特有的物种特有的miRNAmiRNA预测；预测；miRNAmiRNA的靶基因预测；的靶基因预测；对预测的靶基因进行对预测的靶基因进行GOGO分析和分析和KEGGKEGG分析；分析；对已知对已知miRNAmiRNA进行样品间差异分析和聚类分析。进行样品间差异分析和聚类分析。Small RNA研究技术比较转录组转录组Small RNA降解组降解组TextRNADGERNA测序降解组测序降解组：含有降解组：含有5单磷酸的单磷酸的mRNA降解