实验专题模块三血液生化检验 (2)ppt课件

1、实验专题模块三实验专题模块三 血液生化检验血液生化检验p血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳p血清尿素氮的测定血清尿素氮的测定p血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液约占体重的十三分之一，相对密度为1.0501.060，pH值为7.37.4，浸透压为313 mmol/L。p血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。p利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类、脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量，叫做血生化检查。p在正常生理情况下，其各种化学成分的

2、含量非常恒定。但是，机体的生理变化和病理情况，可导致血液的某些化学成分的含量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体物质代谢的情况，并协助诊断或者判别预后。p本专题将引见血清蛋白与血尿素氮等两种生化目的的检测，使同窗们对临床生化检验有一个初步的了解。实验一实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的一、实验目的1. 掌握分别血清蛋白的根本原理及其临掌握分别血清蛋白的根本原理及其临床意义。床意义。2. 了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的操作。仪器的操作。二、背景与原理二、背景与原理血清蛋白的血清蛋白的pI都在都在7.5以下，在

3、以下，在pH为为8.6的巴比妥缓的巴比妥缓冲液中以负离子的方式存在，分子大小、外形也各冲液中以负离子的方式存在，分子大小、外形也各有差别。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上有差别。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上分别成分别成A、1、2、和和五条区带。电泳终了后，五条区带。电泳终了后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色洗去多余染料。将染色后的区带分别用再脱色洗去多余染料。将染色后的区带分别用剪刀分别出来，将其溶于碱液中，进展比色测定，剪刀分别出来，将其溶于碱液中，进展比色测定，最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后最后计

4、算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后的醋酸纤维薄膜透明处置后在扫描光密度计上绘出的醋酸纤维薄膜透明处置后在扫描光密度计上绘出电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百分数。分数。+白蛋白白蛋白(A)12 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子方式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分别成A、1、2、和五条区带。蛋白名称蛋白名称等电点等电点分子量分子量白蛋白4.88690005.061：200002：300005.1290000-1500006.85-7.50156000-300000p 醋酸纤维素二乙酸纤

5、维素薄膜具有匀一的泡沫状构造，浸透性强，对分子挪动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分别明晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分别和免疫电泳等方面。p 醋酸纤维素薄膜经1,4二氧六环、透明液或液体石蜡处置即透明，因此可得背景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性四、四、 实验操作实验操作1. 预备与点样：预备与点样：1 将薄膜切成将薄膜切成2.58cm的小块，在薄膜无光泽面距一的小块，在薄膜无光泽面距一端端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样位置。处用铅笔划一线，表示点样位置。2 将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上

6、缓冲液盛于培育皿中，使膜条自然浸湿下沉。缓冲液盛于培育皿中，使膜条自然浸湿下沉。3 将充分浸透指膜上没有白色斑痕的膜条取出，将充分浸透指膜上没有白色斑痕的膜条取出，用滤纸汲取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻用滤纸汲取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上，使点样线空架。片上，使点样线空架。4 用血色素吸管汲取人新颖血清用血色素吸管汲取人新颖血清35ul，涂于宽，涂于宽2厘厘米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内，移开

7、点样器。点样线上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。2. 电泳:将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面即点样面向下，点样端置于阴极。槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电，电压为10V/cm长指膜条与滤纸桥总长度，电流为0.40.6mA/cm宽，通电一小时左右封锁电源。3. 染色: 通电终了后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立刻浸入盛有漂洗液的培育皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。4. 定量：取试管6支，编好号码，分别用吸管汲取0.4N氢氧化钠4ml。剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的薄膜条作为分光

8、光度法调零管，将各条分别浸于上色述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进展比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白、1、2、球蛋白各管的吸光度值A。5. 计算: 光吸收总和A总AA+A1+A2+A+A各部分蛋白质的百分数为：白蛋白%= (AA / A总)100%; 1球蛋白%= (A1/ A总)100%; 2球蛋白%= (A2 / A总)100%；球蛋白%= (A / A总)100%； 球蛋白%= (A / A总)100%临床意义p 正常值： 白蛋白： 5772% p 1球蛋白：25% p 2球蛋白：49% p 球蛋白： 6.512%p 球蛋白： 122

9、0%p 急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、2及球蛋白减少，球蛋白增高。 p 慢性肝炎：球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。 p 肝硬化：白蛋白、1、2球蛋白均明显下降，球蛋白极度升高，甚至A/G比值倒置。p 肾病综合征时，白蛋白降低，2 、球蛋白升高。实验二实验二 血清尿素氮的测定血清尿素氮的测定一、实验目的一、实验目的1. 掌握血尿素氮的定义及其测定的意掌握血尿素氮的定义及其测定的意义。义。2. 了解二乙酰一肟显色法的原理与操了解二乙酰一肟显色法的原理与操作。作。二、背景与原理尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。通常肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可

10、重吸收，因此在血液中会有少量的尿素存在，普通用血尿素氮BUN来衡量。肾小管内尿流速越快，尿素的重吸收就越少，也即到达了最大去除率。假设肾功能出现了损害，那么有能够导致尿素排出减少，或者是重吸收增多，使得BUN升高。和血肌酐SCR一样，在肾功能损害早期，血尿素氮可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时，血尿素氮的浓度才迅速升高。正常情况下，血尿素氮与肌酐之比BUN/Scr值约为10.1，高蛋白饮食、高分解代谢形状、缺水、肾缺血、血容量缺乏及某些急性肾小球肾炎，均可使比值增高，甚至可达2030；而低蛋白饮食，肝疾病常使比值降低，此时可称为低氮质血症。血尿素氮的检测方法有很多，在本实验中

11、我们将运用二乙酰一肟显色法。该方法的原理是，尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物，颜色深浅与尿素的含量成正比，可经过分过光度法获得尿素含量。因二乙酰不稳定，故用二乙酰一肟来替代。二乙酰一肟与强酸作用，可产生二乙酰，进而再与尿素反响，过程如下：反响在强酸中进展，产生的羟胺是干扰物质，所以须用氧化剂将其氧化除去，可用的氧化剂有过硫酸盐、砷酸、过氯酸、氯胺T以及一些阳离子等。另外，在显色反响中产生的复合物存在着对光不稳定的问题。参与硫氨脲既能提高尿素与二乙酰反响的灵敏度，又能添加其显色的稳定性。硫氨脲假设结合三价铁离子或镉离子一同运用更能提高灵敏度。这样就可以进不除血清蛋白的超微量尿

12、素氮测定。四、实验操作四、实验操作试管编号试管编号1234尿素氮标准液（ml）1234蒸馏水（ml）5432尿素氮的浓度（mg/100ml）10203040系列规范溶液的配制测定液的配制试管编号试管编号123456蒸馏水（L）0000200分别从上表1-4管吸取液体加入对应编号管（L）2020202000血清样品（L）20酸性试剂（mL）5555552% 二乙酰一肟（mL）0.50.50.50.50.50.5混匀后置于沸水中水浴12分钟。置冷水中冷却5分钟后，用540nm进展比色，以5号管作为空白，读取各管光吸收读数。将所得读数作纵座标与相应尿素氮浓度作横坐标在座标纸上作图，绘成规范曲线查规范

13、曲线，得待测血清中尿素氮含量。五、本卷须知五、本卷须知如血浆或血清尿素氮浓度超越如血浆或血清尿素氮浓度超越40mg时，那么时，那么必需将标本用生理盐水稀释后再操作，结必需将标本用生理盐水稀释后再操作，结果乘稀释倍数即可。果乘稀释倍数即可。六、临床意义六、临床意义1. 正常值范围：正常值范围：519mg/100ml2. 能够临床提示：能够临床提示：1血液尿素浓度增高分生理性和病理性要素两方面。血液尿素浓度增高分生理性和病理性要素两方面。A生理要素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显生理要素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高著增高。血清尿素浓度男性

14、比女性平均高0.30.5mmol/L，随年龄添加有增高倾向。成人日间生理变异平均为随年龄添加有增高倾向。成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。B病理要素病理要素a. 肾前性：最重要的缘由是失水，因血液浓缩使肾血流量减肾前性：最重要的缘由是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度添加。少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度添加。b. 肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。含量增高。c. 肾后性疾

15、病：一切使尿路阻塞的要素都可引起血液中尿素肾后性疾病：一切使尿路阻塞的要素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。致使尿道受压等。2血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。常见于肝功能衰竭患者。课堂分组讨论课堂分组讨论患者女性，患者女性，47岁，农民。因反复发作性昏迷半年，岁，农民。因反复发作性昏迷半年，近发作近发作7小时入院。体检：中度昏迷，肝未触及，小时入院。体检：中度昏迷，肝未触及，无瘫痪体征。心电监测以及头颅无瘫痪体征。心电监测以及头颅CT均未发现明显均未发现明显异常。立刻便用甘露醇静脉滴注，异常。立刻便用甘露醇静脉滴注，3小时后患者清小时后患者清醒。诘问病史，患者来自血吸虫病区，醒。诘问病史，患者来自血吸虫病区，3年前因脾年前因脾脏肿大行脾切除术。每次昏迷前均有进食高蛋白食脏肿大行脾切除术。每次昏迷前均有进食高蛋白食物史，但未引起注重。本次发病前在亲戚家进食鸡物史，但未引起注重。本