生物化学检测技术

1、会计学1生物化学检测技术生物化学检测技术电泳槽和大分子分离结果电泳槽和大分子分离结果淀 粉 凝 胶 电 泳聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳凝 胶 支 持 物 区 带 电 泳纸 电 泳 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 薄 层 电 泳非 凝 胶 支 持 物 电 泳用 支 持 物 区 带 电 泳显 微 电 泳 等 电 聚 焦 电 泳 等 速 电 泳不 用 支 持 物 电 泳是 否 用 支 持 物2022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院102022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院11nE 电场强度电场强度nq 颗粒所

2、带电荷颗粒所带电荷nr 颗粒半径颗粒半径n 介质黏度介质黏度上样上样buffer 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液以上溶液4 保存备用。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的大小(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.232.00.122022-4-30韶关大学生命科学学院韶关大学生命科学学院24PCR产物的琼脂糖电泳2022-4-3025 100 200 300 1,650 1,000 500 850 650 400 5,000 bp 2,000DNA ladderD

3、NA ladderPCR 产物产物1 2 3 4 5 6 7 8胶孔胶孔+ - - + - + + -引物二聚体引物二聚体2022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院262022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院302022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院48na Acr克数nb Bis克数2022-4-30韶关大学韶关大学 生命科学学院生命科学学院52n浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，

4、被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。n分离胶的分离胶的T=7.0%-7.5%，C=2.5%，缓冲液为，缓冲液为pH8.9的的Tris-HCl，大部分蛋白质在此，大部分蛋白质在此pH条件下条件下带负电荷。此胶主要起分子筛作用。带负电荷。此胶主要起分子筛作用。2022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院69n在防止对流的情况下，只要有电流存在就在防止对流的情况下，只要有电流存在就可以保持稳定的可以保持稳定的pH 梯度，因为此时由于梯度，因为此时由于扩散和电移动所引起的物质移动处于动态扩散和电移动所引起的物质移动处于动态平衡。平衡。v 在此

5、在此pH梯度中，各种蛋白质迁移到各自的梯度中，各种蛋白质迁移到各自的pI处而得到分离。由此可见，该蛋白质在处而得到分离。由此可见，该蛋白质在“自自然然”pH 梯度中，无论处于何种位置均会向其梯度中，无论处于何种位置均会向其等电点移动，并最终停留在该处。等电点移动，并最终停留在该处。pH3pH10IEFSDS 双向电泳示意图双向电泳示意图n氨基黑10B染不同蛋白质时，着色度不等、色调不一，定量时误差较大，需要对各种蛋白质作出 本身的蛋白质-染料量(吸收值)的标准曲线，更有利于定量测定。2022-4-30南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院882022-4-30南京农业大学南京农业大

6、学 生命科学学院生命科学学院89光的互补光的互补：蓝：蓝 黄黄二、分光光度计的结构原理二、分光光度计的结构原理最常用的是最常用的是可见分光光度计可见分光光度计和和紫外紫外- -可见光分光光度计可见光分光光度计 光源光源单色器单色器样品样品吸收池吸收池检测器检测器信号指示系统信号指示系统五大部份五大部份n结构：结构：（一）光源（一）光源u光源定义：光源定义： 指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的

7、强度不应随波长有明显的好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。变化。 u光源种类：光源种类： 可见光分光光度计常用光源是可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用紫外光光度计常用氢灯氢灯作为光源。作为光源。 （二）单色器（二）单色器u定义：定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。光系统或单色器。 u种类：种类： 滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅（三）比色杯（三）比色杯又称为吸收池或比色皿又称为吸收池或比色皿 u材料：材料：常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成常用无色透明

8、、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 （五）信号指示系统（五）信号指示系统（四）检测器（四）检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。装置。 三、分光光度计的操作方法三、分光光度计的操作方法（一）分光光度计的基本操（一）分光光度计的基本操作作以以721-A721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为型分光光度计为例，其基本的操作步

9、骤为：1.1.开开721-A721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电电2020分钟使仪器预热。分钟使仪器预热。2.2.将波长旋至测定的波长。将波长旋至测定的波长。3.3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。于光路中。4.4.将开关置于将开关置于T T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节细调调节T T为为0.0,0.0,关上关上比色池盖子，调节比色池盖子，调节T T为为100.0100.0。5.5.将开关置于将开关置于A A，用消光调零

10、调节，用消光调零调节A A为为0.00.06.6.重复步骤重复步骤4 4和和5 57.7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A A）721-A分分光光光光度计度计（二）分光光度技术的定量方法（二）分光光度技术的定量方法1.1.标准曲线法标准曲线法 根据根据Lambert-BeerLambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作

11、相同处理，在特定波长下测定吸光度，方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最小二乘法，按最小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。曲线上可查出其相应的浓度。u方法：方法：u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1 1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新）测定条件发生变化时（如更换标准品和试

12、剂等），应重新绘制。绘制。（2 2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。（3 3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4 4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。2 2标准对照法标准对照法 C Cu u=(A=(Au uC Cs s)/A)/As s 己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准同时测定标准管和

13、标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： 其中其中CuCu和和AuAu为标本管浓度和吸光度，为标本管浓度和吸光度，CsCs和和AsAs分别为标准分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。和标本管浓度相近。 3 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多组份混合物分析和利用包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。摩尔吸光系数分析等方法。荧光光度法荧光光度法NanoDrop ND-3300 Fluorospe

14、ctrometer 标准样品CYYXC60（一）火焰光度法（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 1 1基本原理基本原理 2 2组成组成1 1基本原理基本原理 2 2组成组成 3 3原子吸收分光光度法的特点原子吸收分光光度法的特点 三、其它光谱分析技术三、其它光谱分析技术火焰光度法火焰光度法等离子体发射光谱法等离子体发射光谱法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法五种蛋白质测定方法比较如下：五种蛋白质测定方法比较如下： 方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2 1.0mg氮，误差为 2费时 810小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后

15、滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低120mg中速 2030分钟多肽键碱性Cu2紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50100g快速 510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin酚试剂法（Lowry法）灵敏度高5g慢速 4060分钟 双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时

16、；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高15g快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 双缩脲反应双缩脲反应生化自动分析仪生化自动分析仪Vit C 还原产物钼蓝在波长还原产物钼蓝在波长660nm测测定吸光值，当无机磷含量在定吸光值，当无机磷含量在1-25g 范围内，光吸收和含磷量成正比。范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为的含磷量为9.5%，即，即1g RNA磷相当于磷相当于10.5 g RNA。DNA的含磷量平

17、均为的含磷量平均为9.9%。消化管123RNA/mL010标准磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/L H2SO4/mL222消煮炉中消化2-6h至溶液无色透明，冷却dH2O/mL111沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却用dH2O定容/mL505050混匀 1 2 34 5 6标准磷溶液/mL 00.10.20.30.40.5dH2O/mL 1.51.41.31.21.11.0定磷试剂/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 用漩涡混合器混匀，45恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值A660(1) A660(2) A660平均值 A66

18、0平均值空白 07（空白） 8（样品）9（标准）定容溶液/mL 1.51.50.15dH2O/mL 001.35定磷试剂/mL 1.5 1.5 1.5 用漩涡混合器混匀，45恒温水浴保温25分钟 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值空白 0(1) 计算回收率：计算回收率： (2) 计算样品总磷量：计算样品总磷量： (3) 计算计算RNA量：量： (4) 样品样品RNA含量：含量：100%1000500.15y 回收率回收率回收率总磷量总磷量505 . 1)/( xmLgRNA %100)/(2000)/()%( mLgmLgRNARNA 质量浓度质量浓度质量分数质量分数样品样品5 .105 .10%9 . 9)/ 总磷量总磷量）含量含量无机磷量无机磷量（总磷量（总磷量质量浓度（质量浓度（DNAmLgRNA慢慢中等中等快快Temporal course淋洗液淋洗液梯度混合仪梯度混合仪柱层析基本操作步骤基本操作步骤包括：包括：填料处理填料处理装住装住平衡平衡进样进样洗涤洗涤洗脱洗脱复苏复苏/保存保存血浆运输层血浆运输层试剂层试剂层反应层反应层密码磁带密码磁带血浆分离区血浆分离区辅助试剂层辅助试剂层外膜层外膜层干试条的组成干试条的组成化学干片示意图化学干片示意图袋式分析仪的试剂包袋式分析仪的试剂包谢谢 谢谢电泳槽和大分子分离结果电泳槽和大分