电泳检测抗体纯度课件2012123

1、n原理：原理： SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，其是一种阴离子表面活性剂，其SOSO4 4- -为亲水基，为亲水基，CHCH3 3（CHCH2 2）1111- -为疏水基。当蛋白质为水溶性时，为疏水基。当蛋白质为水溶性时，不管蛋白质的种类是什么，大约不管蛋白质的种类是什么，大约1g1g的蛋白质将与的蛋白质将与1.4g1.4g的的SDSSDS结合，蛋白质将解离为多肽，其结合，蛋白质将解离为多肽，其S-SS-S键键也在还原剂的作用下断裂，最终形成也在还原剂的作用下断裂，最终形成SDS-SDS-多肽，多肽，并带有大量过剩的负电荷。当利用聚丙烯酰胺凝并带有大量过剩的负电荷。当利用聚丙烯酰胺凝胶进行

2、电泳时，不管蛋白质的本来的形状和电荷胶进行电泳时，不管蛋白质的本来的形状和电荷如何，都将形成形状和电荷密度类似的如何，都将形成形状和电荷密度类似的SDS-SDS-多肽多肽复合体，并根据其分子量的大小分离。复合体，并根据其分子量的大小分离。 试剂种类 胶 浓 度 5% 7.5% 10% 12.5% 15% 17.5%30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 5 7.5 10 12.5 15 17.51.5M Tris.Hcl(pH8.8) 6 6 6 6 6 610% SDS 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.31.5%(w/v) APS(过硫酸胺) 1 1 1 1 1 1TEMED 0.01

3、5 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015水17.2 14.7 12.2 9.7 7.2 5.2总量 30 ml分离胶组成：分离胶组成： 胶浓度胶浓度 分离范围（KD）5-7.5% 5010-12.5% 20-5015-17.5% 20操作步骤操作步骤：1. 样品制备：样品制备： 样品和变性剂按样品和变性剂按2：1比例混合后立即置于沸水溶中支架上比例混合后立即置于沸水溶中支架上5分钟；分钟； 样品冷却至室温，微型离心机短暂离心。样品冷却至室温，微型离心机短暂离心。2、 分离胶的灌注：分离胶的灌注： 将制胶的装置、将制胶的装置、Teflon梳子、塑料隔条用强碱性去垢剂洗净、风

4、干；梳子、塑料隔条用强碱性去垢剂洗净、风干； 灌胶前用少量酒精将上述装置擦净；灌胶前用少量酒精将上述装置擦净； 将玻璃板和隔胶条固定好，用琼脂封好边缘；将玻璃板和隔胶条固定好，用琼脂封好边缘； 分离胶各试剂充分混合，真空脱气分离胶各试剂充分混合，真空脱气10分钟，分钟，APS和和TEMED在灌胶前再在灌胶前再加；加； 灌注胶液直至液面高度离玻板顶部约灌注胶液直至液面高度离玻板顶部约1.5cm处处; 在胶液上面均匀布一层异丁醇（在胶液上面均匀布一层异丁醇（2-甲基甲基-1-丁醇），异丁醇可用水代替；丁醇），异丁醇可用水代替； 分离胶至少聚合分离胶至少聚合1小时。小时。3、压缩胶的灌注：、压缩胶的

5、灌注： 压缩胶的试剂混合、脱气方法同分离胶；压缩胶的试剂混合、脱气方法同分离胶； 分离胶聚合后倾出上层液体异丁醇，用蒸馏水洗涤胶的上部；分离胶聚合后倾出上层液体异丁醇，用蒸馏水洗涤胶的上部； 灌注压缩胶液；灌注压缩胶液； 将梳子插入玻板之间；将梳子插入玻板之间； 静置聚合静置聚合30分钟。分钟。 4、电泳：、电泳： 小心地取出梳子，上下槽中加入电泳缓冲液（小心地取出梳子，上下槽中加入电泳缓冲液（1*），确保每个样品孔中都充），确保每个样品孔中都充满缓冲液；满缓冲液； 除去样品孔中的气泡和聚丙烯酰胺碎片；除去样品孔中的气泡和聚丙烯酰胺碎片； 每个样品按合适的蛋白质量加样，样品不要溢出样品孔外，避

6、免蛋白质间互每个样品按合适的蛋白质量加样，样品不要溢出样品孔外，避免蛋白质间互相混合；相混合； 将电极导线接至电源，黑的接负极，红的接正极，电泳由负极向正极迁移；将电极导线接至电源，黑的接负极，红的接正极，电泳由负极向正极迁移； 压缩胶部分每块按压缩胶部分每块按8mA(!5mA)电流，当溴酚蓝进入分离胶时，每块胶的电流电流，当溴酚蓝进入分离胶时，每块胶的电流增至增至18mA(30mA)； 溴酚蓝迁移到胶的底部时，即关掉电源，停止电泳。溴酚蓝迁移到胶的底部时，即关掉电源，停止电泳。操作步骤：操作步骤：硝硝 酸酸 银银 染染 色色试剂：试剂：1. 固定液（200ml） 100ml 甲醇 24ml

7、冰醋酸 100ul formalin 76ml 水2. 清洗液（200 ml） 100ml 甲醇或无水乙醇 100ml 水3. 定影液（200 ml） 0.04g Na2S2O3 200ml 水4. 染色液（200 ml） 0.4g AgNO3 150ul formalin 200ml 水5. 显影液（200 ml） 12g Na2CO3 100ul formalin 4ml 0.02% Na2S2O3 185ml 水6. 停止液（200 ml） 100ml 甲醇 24ml 冰醋酸 76ml 水 操作步骤：操作步骤：1.电泳后的凝胶在固定液中固定电泳后的凝胶在固定液中固定1小时以上；小时以上；2.用洗净液浸泡用洗净液浸泡3次，每次次，每次20分钟；分钟；3.在定影液中反应在定影液中反应2分钟；分钟；4.用蒸馏水洗净用蒸馏水洗净3次，每次次，每次5分钟；分钟；5.染色液中反应染色液中反应30分钟；分钟；6