DNA重组酶切和连接

1、预实验结果预实验结果载体载体（3.65kb）1 2 3PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳（的琼脂糖电泳（1%1%）Lane1Lane1：sample 1 sample 1 Lane2Lane2：sample 2 sample 2 Lane3Lane3：sample 3 sample 3 一条带一条带杂带杂带预实验结果预实验结果PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳（的琼脂糖电泳（1%1%）Lane1Lane1：sample 1 sample 1 Lane2Lane2：sample 2 sample 2 Lane3Lane3：sample

2、3 sample 3 两条带两条带三条带三条带DNADNA分子的大小分子的大小琼脂糖浓度琼脂糖浓度DNADNA分子构象分子构象染色剂的量染色剂的量电压电压缓冲液的组成缓冲液的组成缓冲液离子强度缓冲液离子强度等等等等分子克隆上册分子克隆上册, ,第五章第五章一条带一条带 1 2 3我们的结果我们的结果PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳（的琼脂糖电泳（1%1%）Lane1Lane1：MarkerMarker； Lane2Lane2：sample 1; sample 1; Lane3：sample 2; Lane4：sample 31 215000bp10000bp75

3、00bp5000bp2500bp1000bp250bp3 4我们的结果我们的结果质优量少，成功率低质优量少，成功率低质优量足质优量足卫星菌落？卫星菌落？我们的结果我们的结果?电泳行为异常电泳行为异常?我们的结果我们的结果可用可用电泳：尽量减少上样时间，减少扩散；电泳：尽量减少上样时间，减少扩散； 样品尽量均匀分布于胶孔中；样品尽量均匀分布于胶孔中； 尽量远离边缘泳道尽量远离边缘泳道Q&A关于实验中的安全问题关于实验中的安全问题关于酚关于酚- -氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇分层问题：下层分层问题：下层作用问题：酚变性蛋白作用问题：酚变性蛋白 氯仿去除脂类，除酚氯仿去除脂类，除酚 异戊醇消泡

4、，减少表面张力剪切异戊醇消泡，减少表面张力剪切关于酚：关于酚：下层；下层； 氧化判断氧化判断 基因重组基因重组酶切和连接酶切和连接 剪切剪切5NNGOH pGATCCNN33NNCCTAGp HOGNN5 BamHHind+引物引物1 1 5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC 3 CDS CDS 5AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT . AKP CDS . . .CDSCDS .CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3引物引物2 2 3GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAG

5、CG 5BamH1HindpETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT引物引物1 1： 5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3 BamH 引物引物2 2： 5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3 Hind5pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3 3TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp55pApCpGpApApTpTpCpGpT33TpGpCpTpTpApApGpCpAp5Mg2+ ATP T4DNA连接酶连接连接pETBlue-2 3.653kb酶酶 切切连连 接接酶

6、酶 切切pETBlue - AKP(5.2kb)pETBlue-2 3.653kb转化转化复苏复苏 pETBlue-AKP AKPpETBlue-pETBlueAKPAKPu 酶切：酶切：37370 0C C，水浴酶切，水浴酶切3 3小时小时( (封口膜封口）封口膜封口）u 酶切产物的纯化和盒回收：酶切产物的纯化和盒回收： 直接进行液体回收：直接进行液体回收： 每每100uL100uL溶液加入溶液加入500uL500uL溶胶液，其余的操作步骤同前。溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的向柱子的正中央正中央 共共加加20uL20uL洗脱洗脱bufferbuffer，其余步骤同前。其余步骤同前。酶

7、酶 切切 反反 应应 体体 系系管号管号核酸核酸10 xbufferK10 xbufferKddHddH2 2O OBamHIBamHIHandIIIHandIIItube1tube1目的基因目的基因 AKP AKP 24 uL24 uL3 uL3 uL0 uL0 uL2 uL2 uL1 uL1 uLtube2tube2pETBlue-2 pETBlue-2 10 uL10 uL 2 uL2 uL5 uL5 uL2 uL2 uL1 uL1 uL实验操作酶切实验操作酶切每人做一至两份每人做一至两份胶回收原理胶回收原理硅基质材料：硅基质材料：小片段双链小片段双链DNADNA高盐环境与其吸附高盐环境

8、与其吸附 低盐环境与其解离低盐环境与其解离1.1. 每每100uL100uL溶液加入溶液加入500uL500uL溶胶液溶胶液, ,混匀。混匀。2.2. 将液体转移至吸附柱，将液体转移至吸附柱，12000rpm12000rpm离心离心3030秒，去除废液秒，去除废液3.3. 漂洗漂洗: :向吸附柱的向吸附柱的正中央正中央加入加入500uL500uL漂洗液，漂洗液，12000rpm12000rpm离心离心3030秒，去除废液。秒，去除废液。重复一次。重复一次。4.4. 空柱空柱12000rpm12000rpm离心离心2min2min，以彻底去除废液，以彻底去除废液5.5. 将吸附柱置于一新的干净将

9、吸附柱置于一新的干净无菌的无菌的1.5mLEP1.5mLEP管中，向吸附柱管中，向吸附柱的的正中央正中央加加15uL15uL无菌水，室温放置无菌水，室温放置5 5分钟。分钟。12000rpm12000rpm离心离心3030秒，以洗脱秒，以洗脱DNADNA。6.6. 再次向柱子的再次向柱子的正中央正中央加加5uL5uL无菌水，室温放置无菌水，室温放置5 5分钟；分钟；12000rpm12000rpm离心离心2 2分钟。分钟。合并回收液合并回收液。7.7. SYBRSYBR检测回收产物检测回收产物避免乙醇对避免乙醇对酶促反应的酶促反应的影响影响1%1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 25mL (25mL (

10、用用1xTAE1xTAE配配) 1uL GoldView) 1uL GoldView样品：酶切样品：酶切DNA 4uL + 0.5uL 10 xloadingDNA 4uL + 0.5uL 10 xloading质粒对照：未酶切质粒质粒对照：未酶切质粒DNA 2uL DNA 2uL + 0.5uL 10 xloading0.5uL 10 xloading分子量分子量MarkerMarker： 5uL5uL8080伏恒压电泳，结果凝胶成像分析伏恒压电泳，结果凝胶成像分析注意：注意：1)1)MarkerMarker上上5uL5uL时大概的量是时大概的量是50ng/50ng/条带条带2)2)上样上样

11、精准精准3)3)上样顺序（对照）上样顺序（对照）实验操作酶切电泳分析实验操作酶切电泳分析P V0 V1 V1 M连连 接接 反反 应应 体体 系（系（ 20 20 uLuL ）目的基因目的基因AKPAKP载体载体pETBlue-2pETBlue-210 x Ligase 10 x Ligase bufferbufferddHddH2 2O OT T4 4DNADNA连接酶连接酶X X uL uLY Y uLuL2 uL2 uLZ Z uL uL2 uL2 uLu 控制载体和目的基因的比例为控制载体和目的基因的比例为1 1：3 31:101:10u 14 140 0C C连接过夜连接过夜u 明天

12、早晨明天早晨？点各组派代表收样品点各组派代表收样品u 20200 0C C保存，用于转化受体细胞保存，用于转化受体细胞实验操作连接实验操作连接连接产物转化克隆菌株连接产物转化克隆菌株下次实验的简介与准备下次实验的简介与准备1. 0.1mol/L1. 0.1mol/L的的CaClCaCl2 2 100mL 100mL两组，两组，高压灭菌高压灭菌2. LB2. LB液体培养基液体培养基 90mL/90mL/组，组，高压灭菌高压灭菌 胰蛋白胨（胰蛋白胨（typtone) 0.9gtyptone) 0.9g 酵母提取物（酵母提取物（yeast extract) 0.45gyeast extract)

13、0.45g NaCl 0.9g NaCl 0.9g先加先加90mL90mL水溶解后，水溶解后， 5mol/L NaOH5mol/L NaOH调调pHpH值（值（1818L L）分装：分装：250250mLmL锥形瓶，锥形瓶，40mL40mL2 2瓶；瓶； 15mL15mL大试管大试管, 5mL, 5mL2 2管。管。试剂配制试剂配制1. 1. 试剂试剂2. 2. 小指管：小指管： 1.5 mL 501.5 mL 50个个 3. 3. 枪头：枪头： 5 mL 85 mL 8支支4. 50 mL4. 50 mL离心管：离心管： 4 4个个5. 5. 直径直径9cm9cm的平皿：的平皿： 8 8套套

14、6. 6. 其它枪头：各其它枪头：各1 1盒盒灭菌灭菌1. X-gal1. X-gal2. 2. 互补互补 3. 3. 感受态细胞制备感受态细胞制备4. NovaBlue4. NovaBlue菌株菌株5. Tuner(DE2)placI5. Tuner(DE2)placI菌株菌株预习预习endendA A：该基因表达非特异性核酸内切酶，它使所有的DNADNA双链解开。endAendA基因的突变将使插入的外源DNADNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。hsdRhsdR：该基因表达型限制酶，对外源的各种DNADNA有严格的限制。hsdRhsdR基因的变异导致菌株细胞内的型限制酶活性缺失，这对外源基因

15、的导入及质粒的转化是有利的。hsdR17(rk12hsdR17(rk12- -mk12mk12+ +) )：表示R17 R17 的变异而导致K K菌株来源的hsdRhsdR的功能丧失。recA1recA1： recArecA为基因重组相关的基因，表达ATPATP依赖型DNADNA重组酶。该基因突变（recA1recA1）导致同源或异源DNADNA重组不能进行，保持插入DNADNA的稳定性，对DNADNA的转化是有利的。supE44 (Suppressor) supE44 (Suppressor) ： 该基因表达的阻遏蛋白与终止密码子UAGUAG结合，使蛋白质合成终止。Thi-1Thi-1： 该

16、基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶，thi thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1VB1），细胞才能正常生长。 gyrA96(Gyrase):gyrA96(Gyrase): gyrA gyrA基因表达DNADNA促旋酶A A亚基。relA1relA1：是松弛调节基因，对RNARNA的合成具有调节抑制机制。relArelA基因的突变对目的基因的转录有利。proABproAB：表达谷氨酸合成有关的酶。lacIlacIq q： laclac操纵子的调节基因，编码阻遏蛋白。LacLac基因发生变异而使其大量地表达阻遏蛋白，从而使laclac操纵基因几乎完全被抑制。

17、lacZlacZM15M15： lacZ lacZ 的M15M15是表达半乳糖苷酶片端的一段基因，当M15M15缺失（M15M15）时lacZlacZ基因只能表达片端，半乳糖苷酶没有活性。Tn10Tn10（Transposon）： Tn10Tn10是载有四环素抗性基因的转座子。我们的结果我们的结果质优量少，成功率低质优量少，成功率低质优量足质优量足卫星菌落？卫星菌落？我们的结果我们的结果?电泳行为异常电泳行为异常?剪切剪切5NNGOH pGATCCNN33NNCCTAGp HOGNN5 BamHHind+1%1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 25mL (25mL (用用1xTAE1xTAE配配) 1u

18、L GoldView) 1uL GoldView样品：酶切样品：酶切DNA 4uL + 0.5uL 10 xloadingDNA 4uL + 0.5uL 10 xloading质粒对照：未酶切质粒质粒对照：未酶切质粒DNA 2uL DNA 2uL + 0.5uL 10 xloading0.5uL 10 xloading分子量分子量MarkerMarker： 5uL5uL8080伏恒压电泳，结果凝胶成像分析伏恒压电泳，结果凝胶成像分析注意：注意：1)1)MarkerMarker上上5uL5uL时大概的量是时大概的量是50ng/50ng/条带条带2)2)上样上样精准精准3)3)上样顺序（对照）上样顺序（对照）实验操作酶切电泳