复习基因工程的基本操作程序

1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序学习目标：学习目标：1 1、简述基因工程原理及基本操作程序。、简述基因工程原理及基本操作程序。2 2、记住目的基因导入受体细胞的方法。、记住目的基因导入受体细胞的方法。3 3、理解目的基因检测与鉴定的方法、理解目的基因检测与鉴定的方法重点：重点：基因工程基本操作程序的四个步骤，基因工程基本操作程序的四个步骤，难点：难点：1 1、从基因文库中获取目的基因。、从基因文库中获取目的基因。 2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因。技术扩增目的基因。考点：考点：基因工程原理及基本操作程序基因工程原理及基本操作程序三、基因工程的基本操作程

2、序三、基因工程的基本操作程序1.1.目的基因的获取目的基因的获取（1 1）目的基因：编码蛋白质的）目的基因：编码蛋白质的_。基因基因1.1.目的基因的获取目的基因的获取（1 1）从）从基因文库基因文库中获取目的基因：如从基因中获取目的基因：如从基因组文库或组文库或cDNAcDNA文库中获取。文库中获取。（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增目的基因：利用目的基因：利用DNADNA复复制的原理在体外特异性的复制某制的原理在体外特异性的复制某DNADNA片段以获片段以获得呈指数方式增加的目的基因。得呈指数方式增加的目的基因。（3 3）人工合成法人工合成法：通过：通过DNADNA合成仪用化

3、学方合成仪用化学方法直接人工合成。法直接人工合成。(3)PCR技术与DNA复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理DNADNA双链复制双链复制( (碱基互补碱基互补配对配对) )原料原料四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸条件条件模板、模板、ATPATP、酶等、酶等PCRPCR技术技术DNADNA复制复制不不同同点点解旋解旋方式方式DNADNA在高温下在高温下变性解旋变性解旋解旋酶催化解旋酶催化场所场所体外复制体外复制主要在细胞核主要在细胞核内内酶酶热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶酶) )细胞内含有的细胞内含有的DNADNA聚合酶聚

4、合酶结果结果在短时间内形在短时间内形成成大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心（1 1）由图可知载体的组成：）由图可知载体的组成：_、启、启动子、终止子、动子、终止子、_。目的基因目的基因标记基因标记基因启动子、终止子启动子、终止子: :是基因转录的起点和终是基因转录的起点和终点，点，在转录过程中起调控作用在转录过程中起调控作用。 标记基因标记基因: :作用是为了作用是为了鉴别受体细胞中是鉴别受体细胞中是否含有目的基因否含有目的基因, ,从而将含有目的基因的细从而将含有目的基因的细胞筛选出来胞

5、筛选出来, ,如抗生素抗性基因。如抗生素抗性基因。 目的基因：能控制特定性状的外源基因。目的基因：能控制特定性状的外源基因。（2 2）构建目的：）构建目的： 使使_ _ 在在_ _ 中稳定存中稳定存在，并且可以遗传给下一代；在，并且可以遗传给下一代； 使使_ _ 能够表达和发挥作用。能够表达和发挥作用。目的基因目的基因受体细胞受体细胞目的基因目的基因(3)(3)基因表达载体的构建步骤基因表达载体的构建步骤导入的目的基因的表达需要调控导入的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。前需有启动子，之后需有终止子。3 3将目的

6、基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物生物种类种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用常用方法方法农杆菌转化法农杆菌转化法 显微注射技术显微注射技术CaCa2 2处理法处理法受体受体细胞细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化转化过程过程将目的基因插将目的基因插入到入到TiTi质粒的质粒的T TDNADNA上上农杆农杆菌菌导入植物导入植物细胞细胞整合到整合到受体细胞的受体细胞的DNADNA表达表达将含有目的基将含有目的基因的表达载提因的表达载提纯纯取卵取卵( (受受精卵精卵) )显微显微注射注射受精卵受精卵发育发育获得具获得具有新性状的动有新性状的动物物CaCa

7、2 2处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载重组表达载体与感受态细体与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNADNA分子分子4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定【点拨【点拨】启动子、终止子与起始密码子、启动子、终止子与起始密码子、终止密码子不同：终止密码子不同：启动子、终止子在启动子、终止子在DNA DNA 上上, ,在遗传信息转在遗传信息转录时起调控作用；录时起调控作用；而起始密码子、终止密码子在而起始密码子、终止密码子在mRNAmRNA上上, ,在在翻译时起作用翻译时起作用, ,决定翻译的开始和结束。决定翻译的开始和结束。【典例训练【典例训练1 1】我国科

8、学家成功克隆了控制我国科学家成功克隆了控制水稻理想株型的关键多效基因水稻理想株型的关键多效基因IPA1IPA1。研究发。研究发现，基因现，基因IPA1IPA1发生突变后，会使水稻穗粒数发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重（以克表示的一千粒种子的重量）和千粒重（以克表示的一千粒种子的重量）增加，同时茎秆变得粗壮，增加了抗倒伏能增加，同时茎秆变得粗壮，增加了抗倒伏能力。实验显示，将突变后的力。实验显示，将突变后的IPA1IPA1基因导入常基因导入常规水稻品种，可以使其产量增加规水稻品种，可以使其产量增加1010以上。以上。下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据图

9、回答：图回答：（1 1）上图所示流程中步骤）上图所示流程中步骤是实验所用技术是实验所用技术的核心步骤。此步骤使的核心步骤。此步骤使_ _ 和和_构成构成_ ，常用的工具酶是，常用的工具酶是_。突变的突变的IPA1IPA1基因基因TiTi质粒质粒重组重组DNADNA限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNADNA连接酶连接酶（2 2）若要在体外扩增）若要在体外扩增IPA1IPA1基因可采用基因可采用PCRPCR技术。标准的技术。标准的PCRPCR过程分为三个步骤，第一过程分为三个步骤，第一步是步是“变性变性”即解旋，这一步骤如果发生在即解旋，这一步骤如果发生在细胞内，是在细胞内，是在_的作用下完

10、成的。的作用下完成的。DNADNA解旋酶解旋酶（3 3）从变异类型上分析，该水稻的新性状）从变异类型上分析，该水稻的新性状应该属于可遗传变异中的应该属于可遗传变异中的_ 。（4 4）过程应用的主要生物技术是过程应用的主要生物技术是_。基因重组基因重组植物组织培养植物组织培养【互动探究【互动探究】（1 1）图中将目的基因导入植物受体）图中将目的基因导入植物受体细胞常用的方法是什么？细胞常用的方法是什么？提示：提示：农杆菌转化法。农杆菌转化法。分析：分析：将目的基因导入植物受体细胞常用农杆菌将目的基因导入植物受体细胞常用农杆菌转化法。将目的基因导入动物受体细胞常用显微转化法。将目的基因导入动物受体

11、细胞常用显微注射技术。注射技术。（2 2）如何检测导入水稻新品种植株的目的基因是）如何检测导入水稻新品种植株的目的基因是否表达？否表达？提示：提示：进行抗原进行抗原抗体杂交法。抗体杂交法。分析：分析：检测导入的目的基因是否表达常用抗原检测导入的目的基因是否表达常用抗原抗体杂交法或进行个体水平的检测。抗体杂交法或进行个体水平的检测。【高考警示钟【高考警示钟】 1.1.目的基因的插入位点不是随意的目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。位。2.2.基因工程

12、操作过程中第三步没有碱基互补基因工程操作过程中第三步没有碱基互补配对现象配对现象第一步存在逆转录法获得第一步存在逆转录法获得DNADNA，第二步存在黏，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。杂交方法。【典例训练【典例训练2 2】（20112011山东高考改编）人类山东高考改编）人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。（1 1）图中的高血压相关

13、基因作为）图中的高血压相关基因作为_，质粒作为质粒作为_，二者需用，二者需用_切割后连接成重组载体，该过程与质粒上切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有含有_ _ 有关。有关。（2 2）重组）重组DNADNA导入的受体细胞是大鼠的导入的受体细胞是大鼠的_细胞，常用的方法是细胞，常用的方法是_。在在DNADNA重组过程中核心的操作是重组过程中核心的操作是_。（3 3）子代大鼠如果）子代大鼠如果_和和_，即可分别在分子水平和个体水，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。可用其建立高血压转基因动物模型。

14、（4 4）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胎培养和_。目的基因目的基因载体载体同一种限制性核酸内切酶同一种限制性核酸内切酶受精卵受精卵限制性核酸内切酶的切割位点限制性核酸内切酶的切割位点显微注射技术显微注射技术基因表达载体的构建基因表达载体的构建检测到相应蛋白质检测到相应蛋白质已患高血压已患高血压胚胎移植胚胎移植【解题指南【解题指南】1.1.考查实质考查实质本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。2.2.解题关

15、键解题关键高血压相关基因与质粒形成重组高血压相关基因与质粒形成重组DNADNA后导入到受精卵细胞中，是后导入到受精卵细胞中，是DNADNA重组技术。重组技术。【解析【解析】（1 1）根据题干中）根据题干中“利用正常大鼠制备遗传性高血压转基利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠因模型大鼠”推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。（2 2）重组）重组DNADNA分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物细胞

16、导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重组组DNADNA分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体的构建是整个过程中的关键。的构建是整个过程中的关键。（3 3）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明目的基因已经表达。目的基因已经表达。 (4)(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎

17、工程在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。【互动探究【互动探究】（1 1）如果把鼠换成植物，则导入受体细胞的常用）如果把鼠换成植物，则导入受体细胞的常用方法改变吗？方法改变吗？提示：提示：变成农杆菌转化法。变成农杆菌转化法。分析：分析：植物细胞与动物细胞具有不同的特点，导入的方法是根植物细胞与动物细胞具有不同的特点，导入的方法是根据操作的需要进行的，如利用农杆菌易感染植物的特性。据

18、操作的需要进行的，如利用农杆菌易感染植物的特性。（2 2）分子水平检测除蛋白质检测外还有什么检测方法）分子水平检测除蛋白质检测外还有什么检测方法? ?提示：提示：DNADNA分子杂交、核酸分子杂交。分子杂交、核酸分子杂交。分析：分析：利用利用DNADNA探针检测目的基因或相应的探针检测目的基因或相应的mRNAmRNA存在与否，说明存在与否，说明目的基因是否存在或是否转录。目的基因是否存在或是否转录。1.1.（20122012福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最新研究发现，一种植物激素新研究发现，一种植物激素油菜素内酯能促进农药在植物油菜素内酯

19、能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因多参与农药降解的基因( (如如P450P450和和GsTGsT) )的表达和酶活性都得到提的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的高，在这些基因的“指导指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：（1 1）获得油菜素内酯基因的方法有）获得油菜素内酯

20、基因的方法有_（举二项即（举二项即可）。第可）。第步用步用PCRPCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指_。步骤。步骤用到的酶有用到的酶有_。（2 2）图中导入重组质粒的方法是）图中导入重组质粒的方法是_。在导入之前。在导入之前 应用应用_处理。处理。（3 3）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用 _制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养 基中加入基中加入_可将含有目的基因的细胞筛选出来。可将含有目的基因的细胞筛选出来。（4 4）请你为该课题命名）请

21、你为该课题命名_。（5 5）请你说说该研究发现的生态学意义：）请你说说该研究发现的生态学意义： _ _ _。【解析【解析】（1 1）油菜素内酯基因是目的基因，获得目的基因的方）油菜素内酯基因是目的基因，获得目的基因的方法有：从法有：从cDNAcDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用因或利用PCRPCR技术扩增等。技术扩增等。PCRPCR技术中耐高温的酶是技术中耐高温的酶是DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）。步骤酶）。步骤是对质粒进行剪切和拼接，要用到限制酶和是对质粒进行剪切和拼接，要用到限制酶和DNADNA连接酶。（连接酶

22、。（2 2）将重组质粒导入受体细菌中，采用）将重组质粒导入受体细菌中，采用CaCa2+2+转化转化法，导入前应用法，导入前应用CaClCaCl2 2溶液处理，成为感受态细胞，增加受体细溶液处理，成为感受态细胞，增加受体细菌细胞壁的通透性。（菌细胞壁的通透性。（3 3）对目的基因进行检测和筛选中应用红）对目的基因进行检测和筛选中应用红霉素抗性基因制成探针，检测是否导入重组基因；为筛选出含有霉素抗性基因制成探针，检测是否导入重组基因；为筛选出含有目的基因的细胞可在培养基中加入红霉素。（目的基因的细胞可在培养基中加入红霉素。（4 4）课题命名可以）课题命名可以是：探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分

23、解。（是：探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解。（5 5）该项研该项研 究的意义：加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利究的意义：加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康。于环境保护和人体健康。答案：答案：（1 1）从）从cDNAcDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用目的基因或利用PCRPCR技术扩增（任答两项即可）技术扩增（任答两项即可） TaqTaq酶酶 限制酶和限制酶和DNADNA连接酶连接酶（2 2）CaCa2+2+转化法转化法 氯化钙溶液氯化钙溶液（3 3）红霉素抗性基因）红霉素抗性基因红霉素

24、红霉素 （4 4）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解（5 5）加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保）加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康护和人体健康2.(20102.(2010福建高考福建高考) )红细胞生成素（红细胞生成素（EPOEPO）是体内促进红细胞生）是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPOEPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生

25、产的重组人红细胞生成素（工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPOrhEPO），其简要生产流），其简要生产流程如图。程如图。请回答：请回答：（1 1）图中）图中所指的是所指的是_技术。技术。（2 2）图中）图中所指的物质是所指的物质是_，所指的物质是所指的物质是 _。 （3 3）培养重组）培养重组CHO CHO 细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产 物积累对细胞自身造成危害，应定期更换物积累对细胞自身造成危害，应定期更换_。（4 4）检测）检测 rhEPOrhEPO的体外活性需用抗的体外活性需用抗rhEPOrhEPO的单克隆抗体。分泌的单克隆抗体。分泌

26、 该单克隆抗体的该单克隆抗体的_细胞，可由细胞，可由rhEPOrhEPO免疫过的小鼠免疫过的小鼠B B 淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。【解析【解析】本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。获程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。获取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用PCRPCR扩增技术、扩增技术、用反转录法、用化学合成法），由图以核用反转录法、用化学合成法），由图以核DNADNA为模板获得

27、目的基为模板获得目的基因的方法可知因的方法可知为为PCRPCR技术。进行反转录的模板是技术。进行反转录的模板是mRNAmRNA。由题意。由题意可知重组可知重组CHOCHO细胞适用于生产重组人红细胞生成素细胞适用于生产重组人红细胞生成素(rhEPO(rhEPO），所），所以重组以重组CHOCHO细胞能够表达出重组人红细胞生成素细胞能够表达出重组人红细胞生成素(rhEPO(rhEPO）或者红）或者红细胞生成素。培养动物细胞是用液体培养基即培养液，细胞从细胞生成素。培养动物细胞是用液体培养基即培养液，细胞从培养液中吸收营养，并同时向培养液中排放代谢废物，当代谢培养液中吸收营养，并同时向培养液中排放代

28、谢废物，当代谢废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。制备单克隆废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。制备单克隆抗体是让抗体是让B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂交瘤细胞来分泌抗体。交瘤细胞来分泌抗体。答案：答案：（1 1）PCR PCR （2 2）mRNA rhEPOmRNA rhEPO （3 3）培养液）培养液 （4 4）杂交瘤）杂交瘤3.(20113.(2011海南高考海南高考) )回答有关基因工程的问题：回答有关基因工程的问题：（1 1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割）构建基因工程表达载体时，用不

29、同类型的限制酶切割DNADNA 后，可能产生黏性末端，也可能产生后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限末端。若要在限 制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生二者产生_（相同、不同）黏性末端的限制酶。（相同、不同）黏性末端的限制酶。（2 2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆处理大肠杆

30、菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNAmRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNAmRNA杂交，该杂交杂交，该杂交技术称为技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的。为了检测胰岛素基因转录的mRNAmRNA是否是否翻译成翻译成_，常用抗原，常用抗原抗体杂交技术。抗体杂交技术。（3 3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌要将目的基因插入农杆菌TiTi质粒的质粒的_中，然后用该农中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过杆菌感染植物细胞，通过DNADNA重组将目的基因插入植物细胞的重组将目的基因插入植物细胞的_上。上。【解析【解析】（1 1）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；若用若用DNADNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。（2 2）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNADNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；分子杂交