ELISA技术及其在猪病诊断中的应用

1、ELISA技术及其在猪病诊断及净化中的应用周荷田1杨丹凤1 张志庆1罗敏娟1吴树华2高洋根1*（1.南昌金牧动物动物保健服务有限公司，南昌 330013 ）（2.永丰县农业局 永丰 331500）摘要：血清学检测是一种特异性的诊断方法，也被称为抗原或抗体检测，是根据 抗原与相应抗体在适宜的条件下，能在体外发生特异性结合的原理用已知抗体或抗原 来检测未知抗原或抗体。目前在动物疫病诊断中常用的血清学方法有：间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent AssafLISA）和病毒中和 试验等。其中，ELISA技术是现代养猪业应用最广、发展最快的一项

2、血清学诊断技术。 其特点是灵敏度高、特异性强、安全性高以及操作简单，从而适用于大规模猪场的抗 体水平检测或者临床大量样品的检测。本文就ELISA技术的原理及其在猪病诊断及猪 疫病防控中应用做了简单的阐述，并分析了检测过程中极易出现的关键问题。关键词：ELISA技术；猪病诊断；问题酶联免疫吸附试验（ELISA）,是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，它不仅 只应用于动物疫病的诊断，也是监测各病原抗体水平的主要手段，从而对免疫质量进 行评估，有效地进行动物疫病的预防11在动物疫病防控的临床实践工作中，ELISA 技术扮演了重要的角色，发挥其有效的疫病监测作用，进而促进了我国畜牧业稳健和 长远的发

3、展21实际工作中，特异性的抗体检测为兽医工作者了解动物疫病防控、治 疗效果及预后的情况提供了有效数据。在生物的免疫应答的过程中，具体液免疫和细 胞免疫是相互影响、相互促进的过程，动物在初次接种疫苗一定时间后，其体内就会 形成相应的有效抗体，此时通过采集血清样品进行抗体检测，获得有效的抗体水平数 据，就可以对该猪场的免疫效果进行有效的评估，从而判断其疫苗质量、免疫程序甚 至其免疫手段是否合理。同样地，动物感染了相关病原，具体内形成相应的抗体也可 以通过抗体检测得到相关数据，进而可以为诊断、治疗动物疫病提供必要的依据，从 而提高治疗效果，并为后期的疫病防控工作奠定了基础。由此可见， ELISA技术

4、在我 国畜牧业有着举足轻重的价值。作者简介：周荷田（1990-）,女，江西金溪人，学士，主要从事动物疫病检测和研究， E-mail-mail:gaoyanggen152通讯作者：高洋根（1990-）,男，江西万载人，硕士，研究方向：动物传染病学和兽医微生物学,1 ELISA1.1.1 ELISA反应原理ELISA是以免疫反应为基础，根据抗原抗体反应结合的特异性以及酶催化反应的 高敏感性而建立的非放射性标记免疫检测技术。包被抗原（或抗体）常用的载体一般 是聚苯乙烯微量滴定板，凹形小孔。同时用于标记的酶必须稳定，具有高度的特异性 和敏感性，最常用的是辣根过氧化物酶（Hor

5、seradish PeroxidaseHRP）,其次为碱性磷 酸酶（alkaline phosphatase,AKP）。用于包被的抗原或抗体能牢固地吸附于固相载体表 面，并保持其免疫活性。检测时，待检样品与吸附于固相载体表面的已知抗原或抗体 结合，然后洗去包被板孔内游离的反应物，加入酶标抗原或酶标抗体即可在载体上进 行免疫酶反应，洗去未结合的酶标，加入底物四甲基联苯胺（TMB）显色后加终止液。 此时产物的量与样品中待检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量 分析3】。由于酶的高效率催化，因此反应结果可以被放大，所以 ELISA试验结果可用 肉眼观察，也可用测定仪在特定的分光光度值下

6、测定样本的光密度（ OD）值41 1.2 ELISA反应基本类型 1.2.1 直接法最简单的ELISA反应，将抗原或抗体包被于固相载体表面，实验时直接加入酶标 抗原或酶标抗体进行反应，可用于直接检测抗原或者抗体。1.1.2 间接法将已知抗原包被在微量反应板上，待检样品在反应孔内孵育时，针对特异性抗体 与包被的抗原形成抗原抗体复合物。洗去未结合的物质后加入辣根过氧化物酶标记的 抗抗体，它与反应孔中的抗体结合。洗去其他游离成分，再加入 TMB底物显色。颜 色的深浅与样品中存在的抗体成正比。本法主要用于测定抗体，具优点是只要变换包 被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。1.1.3 夹心

7、法又称双抗体法，将纯化的特异性抗体包被于固相载体，加入待检抗原样品，温育 后洗涤，加入酶标记的特异性抗体，没有结合的酶标抗体结合物被洗去，加入TMB底物显色，产物颜色的深浅与样品中的抗原含量成正比。此方法用于测定大分子抗原。1.1.4 双夹心法将抗体（Ab1）吸附在固相载体上，洗去未吸附的抗体，加入待测抗原（ Ag）样 本，其与周相载体上的抗体结合后，洗去未结合的游离物质，加入不同动物制备的特异性相同的抗体（Ab2）,此时，Ab2会与待测抗原结合，再次洗涤后加入酶标记的抗 Ab2抗体（Ab3）,其结合在Ab2上后即形成了 Ab1-Ag-Ab2-Ab3-HRP复合物。洗涤后 加入底物显色，产生的

8、颜色深浅与样本中的抗原呈正比5双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能 形成两位点夹心。其优点是不必标记每种抗体，还能提高实验的敏感性。1.1.5 阻断 ELISA用抗原包被固相载体，加入待检样品，然后加入酶标单克隆抗体，最后加底物显 色。呈色反应的深浅与样品中的抗原呈反比，主要用于测定抗体。2 ELISA在猪病防控中的应用2.1 ELISA在猪细菌性疾病诊断中的应用周明光6】用改良的方法提取猪2型链球菌的荚膜多糖，将其包被于微量反应板上， 建立了间接抗体检测方法，同时通过试验优化了其反应条件， 进行了敏感性、特异性、 重复性、保存期试验

9、等研究，研制出猪型链球菌间接ELISA抗体检测试剂盒。间接ELISA试验具有很好的快速、简便、高特异性以及高灵敏度等特点，与其他实验室诊 断技术相比，该方法更加适用于临床标本的检查。 更小静7】以纯化的猪链球菌GDH基 因重组原核表达产物作为包被抗原，酶标葡萄糖球菌 A蛋白为二抗，建立了检测猪链 球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法，各种优化试验表明，所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、敏感性高，为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清 学诊断提供有效的技术手段。马福利等 8如用超声波击碎副猪嗜血杆菌分离株 5型菌 体，使菌体可溶性蛋白和多糖抗原等菌体抗原充分释放，过滤后取上清

10、作为包被抗原，初步建立了副猪嗜血杆菌抗体的间接 ELISA检测方法，特异性、敏感性和符合性试验 结果显示，其建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于临 床上快速诊断副猪嗜血杆菌的检测方法及其流行病学的调查，同时丰富了副猪嗜血杆 菌的血清学诊断方法。2.2 . ELISA在猪病毒性疾病诊断中的应用冯春花等9 口原核表达、纯化的猪瘟病毒（CSFV） E2主要抗原区的重组蛋白为 目标抗原，试验建立的过程中充分考虑了反应条件的筛选和优化，最终确定了反应的 最适条件，建立了 CSFV抗体的间接ELISA检测方法。与进口阻断ELISA试剂盒进 行比较，其结果符合率较高，试验表明此法

11、可用性较好。柴虹等10用纯化白重组PRV gE主要抗原表位蛋白为包被抗原，建立了检测猪伪 狂犬病血清抗体的间接ELISA检测方法，进行了交叉反应和平行试验，结果表明猪伪 狂犬病血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性，且重复性好。黄立平等11轲用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种阻断 ELISA方法， 旨在检测猪血清中PCV2中和抗体，该方法的建立为PCV2病毒的血清流行病学调查、 致病机理得研究及疫苗的免疫效价提供了 一种有效的技术手段。何奇才&等12料用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原，FMDV阳性血 清的竞争抗体则用PET-32a-V

12、P1蛋白免疫家兔获得的阳性血清，建立FMDV抗体的竞 争ELISA检测方法，并进行了条件优化，同时与液相阻断ELISA试剂盒进行比较试验,结果显示，检测FMDV抗体的竞争ELISA检测方法的敏感性好、特异性强、重 复性好，可用于。型FMDV血清抗体水平的检测。沈婷等13女乙型脑炎病毒（JEV）弱毒疫苗株作为诊断抗原，并优化了 ELISA反应 条件，初步建立了检测猪乙型脑炎病毒血清抗体的间接ELISA检测方法。与此同时，用所建立的方法初步调查了华东地区猪乙型脑炎血清流行病学，同时随机抽取135份血样与国产商品化试剂盒进行比较，结果显示其符合率高达95%。表明其建立的猪乙型脑炎病毒血清抗体的间接E

13、LISA检测方法具有良好的特异性、重复性和敏感性，适 用于猪乙型脑炎血清进行大规模的抗体水平监测、免疫普查以及流行病学调查。2.3 ELISA在猪主要疫病病抗体水平监控中的应用修金生等14垢用HerdChek猪瘟抗体检测试剂盒检测福建省10个不同规模养猪场 的种猪血清抗体，评价种猪群猪瘟免疫状况，随后对猪瘟抗体不合格的种猪加强免疫， 经过一段时间再次检测其猪瘟抗体，然后淘汰不合格的种猪，从而达到净化的目的。 张华等15物了解2012 2014年贵州省猪瘟免疫防控情况，采用间接ELISA检测方法， 对随机采集我省9个市（州）11,390个场点113,342份经过猪瘟疫苗免疫后的猪血清样 品，进行

14、猪瘟免疫抗体检测，获得准确的抗体水平数据，从而计算出20132014年贵 州省猪瘟免疫抗体的合格率，统计分析出贵州省近3年的猪瘟免疫防控工作的效果。戴爱玲等16%了 了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水 平，采用ELISA法对20102013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1217份进行猪伪狂犬野毒（gE）抗体和免疫（gB）抗体检测，并对其进行分析，从而对该猪场的 疫病有一个全面的了解。金燕娟等17L用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术分别对某猪场经典猪瘟病 （CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）和高致病性蓝耳病病毒（PRRSV）的抗体水平进行了 检测，并根据其结果进行抗体

15、分析，调整和完善其猪场的免疫程序。同时达到对疫病 的实际情况予以实时监测，收集较全面的数据，有利于兽医工作者对数据进行分析， 做出疫病的发生及流行情况正确的预测。邱美珍等18就用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测了该规模猪场10个阶段184份血清4种疫病5种抗体水平，同时根据该猪场的免 疫程序，了解到该猪场母源抗体及疫苗免疫抗体消长规律，并对其相关的免疫程序进 行了调整。本实验室所采用的猪瘟抗体的检测试剂盒购自美国IDEXX公司，其利用阻断ELISA原理检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体。将按比例稀释好待检的血清样品加入 猪瘟病毒抗原包被的微量包被板， 室温孵育2h,洗板后加入100人抗CSFV

16、辣根过氧 化物酶标记抗体，室温孵育30min,洗板后加入100人底物显色液，室温避光显色 10min,加入100也终止液，混匀后用酶标仪在 450nm处测定吸光度值。通过计算判 定CSFV抗体的阴阳性。实时监控好场内疫病的抗体水平，根据猪场提供的免疫程序 及猪场内相关背景资料，做出分析，为猪场提供准确的建议，甚至完善其免疫程序， 从而完成疫病的净化。3 ELISA常见问题及原因分析整个抗体检测过程中，最基本也是最重要的就是血清样品的质量，所以对于血样 的采集到运输至实验室的过程中尤其应注意以下几个要点：(1)抽血的速度不要太快；(2)采完血后要在血液和管口之间留一定的空间， 尽快倾斜放置(45

17、C角或平放) 至少30min；(3)运输时要加冰块，且尽量避免剧烈晃动。在保证样品质量合格的情况下，在 ELISA操作过程中，操作前将所有试剂和反应 板在室温下回温至少1h,冬天室温低，可放置在25。叵温箱中，回温时间相对延长， 回温时间太短会使试剂不能完全混匀，样品孵育时间相对缩短，导致 ELISA反应不够 充分，止匕外，反应板的回温可以有效避免“边缘效应”。试验过程中，必须严格按照说 明书步骤进行操作，严格控制操作及样品反应时间，减少孵育时间人为延长的误差， 导致非特异性结合附着在微量反应板内，从而对实验结果的准确性产生影响。另一重 要的影响因素则是反应温度，ELISA技术对反应温度十分敏

18、感，在实验过程中应该格 外注意环境温度和实际反应温度，室温反应时应避免放置在阴凉或阳光直射处，放在有吹风的恒温箱反应时，应避开吹风口或者挡住出风口，防止由此而导致的 OD值偏 低。再者，实验操作中最易受影响的过程就是洗板，本实验室采用的是手工洗板，洗 板时要求垂直甩板，避免交叉污染，洗完板后在吸水纸如干净、无纸屑的卫生纸或者 纱布上轻轻拍干，每次要避免在同一位置拍板，最后一次拍板时，吸水纸上不能有颜 色，减少使其OD值偏高的影响因素。止匕外，实验所用的所有试剂尽量不要混用，更 不能用过期的试剂！尽管ELISA技术是一项传统实验室技术，但其在动物疫病中的应用十分广泛，随 着单克隆抗体技术与酶标记

19、技术的发展与应用，其应用领域已经有了进一步的延伸 19，越来越多的商品化试剂盒被生产使用，克服了传统ELISA技术局限在实验室操作的缺点，ELISA试剂盒的生产与应用，使得ELISA技术成为规模化养殖场进行自我监 控抗体水平、预测疫情成为可能。如今，它不仅仅是一种简单的疫病诊断技术，已经 成为疫病防控的重要一部分，成为规模化猪场免疫效果评估、疫病诊断和净化的一种 有效途径，因而也越来越被养殖户所重视。相信随着科技的发展与投入，ELISA技术会有更好的应用前景。参考文献1毛晓婷.抗体检测技术在动物疫病防控中的应用分析J.湖北畜牧兽医，2016,37(01):30-31.2吕金良.抗体检测技术在动

20、物疫病防控中的应用分析J.当代畜牧，2014(02):72-73.3曲站红，邓国华，贾永清.ELISA技术及其在禽病诊断中的应用J.畜牧兽医科技信息息,2006,01:64-66.4杨汉春.动物免疫学M.第二版，北京：中国农业大学出版社，2003.8:314-317.5库大亮，李冬.酶联免疫吸附试验在口蹄疫诊断中的研究进展J.中国农学通报，2011,29:27-32.6周明光.猪2型链球菌间接ELISA和间接血凝抗体检测方法的建立及应用D.华中农业大学,2007.7夏小静.猪链球菌GDH基因克隆表达及其 PPA-ELISA抗体检测方法的建立与应用 D.山东农 业大学，2012.8马福利，王丽荣，董永军，刘运平，王秋霞，梁莹莹.副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用J.西北农业学报,2015,05:29-33.9冯春花，朱艳平,郭东光，等.猪瘟病毒抗体间接 ELISA检测方法的建立及优化J.中国畜牧兽 医，2016,43(03):608-614.10柴虹，范忠军，陈义平，等.猪伪狂犬病血清抗体 gE-ELISA检测方法的建立J.中国兽药杂 志,2007,41(07):9-12.11黄立平，刘长明，危艳武，等.猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断 ELISA检测方法的建立及应用J.中