园艺植物遗传转化载体的构建

1、园艺植物遗传转化载体的构建主要内容 根癌农杆菌Ti质粒基因转载体的构建 发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构建 载体构建中常用的选择标记基因和报告基的因 园艺植物常用的遗传转化载体类型 目的基因与载体的连接 能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。载体（载体（vector） ？一个理想的载体应该具备以下几个特点： 有一个或多个复制起点，可在一种生物体中自主复制 至少有一个多克隆位点，以供外源DNA插入 至少有一个遗传标记基因，以指示重组DNA分子是否进入宿主细胞 具有较小的分子质量和较高的拷

2、贝数 无毒性基因工程中所用载体的分类 按来源分类 细菌质粒 噬菌体类酵母质粒 病毒DNA衍生物基因工程中所用载体的分类 在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒，按用途可分为：克隆载体表达载体转化载体按功能及构建过程分类 根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。 农杆菌属（农杆菌属（Agrobacterium）有有2 2种重要植物病原菌种重要植物病原菌根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfaciens) ) 携带有携带有Ti质粒（质粒（Tumor-inducing plasmid）发根农杆菌（发根农杆菌（Agrobacterium rhizog

3、enesis） 携带有携带有Ri Ri 质粒质粒(Root(Root-inducing plasmid) 在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌大肠杆菌质粒，农杆菌质粒质粒，农杆菌质粒)和植物病毒作为载体。其中以根癌农和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重点介绍的内质粒转化载体是最为重要，是本章重点介绍的内容。容。冠瘿瘤病(根癌病)症状1、植物根及茎基部产生、植物根及茎基部产生 2、最初原因是受伤后引起、最初原因是受伤后引起 alfalfa根癌农杆菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfac

4、iens）发根农杆菌发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 Ti质粒的发现历史质粒的发现历史1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumor inducing plasmid）,简称Ti质粒.最初的发现和命名是1907年,Smith 和Townsent发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱发形成的.Ti质粒的遗传特性及类型质粒的遗传特性及类型 Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状质粒

5、为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为分子，其分子量为9.51071.6108，大小为，大小为180250kb。 迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的们的Ti质粒结构特性均有差别。质粒结构特性均有差别。 根据根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，种类不同，Ti质粒可质粒可被分为四种类型：章鱼碱型被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型、农杆菌素碱型(agrocinopine)

6、或称琥珀碱或称琥珀碱型型(succinamopine)。 其中，章鱼碱型和胭脂碱型其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。质粒较为常见。Ti质粒的基因位点及其功能区域质粒的基因位点及其功能区域Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区（区（transferred-DNA regions）: T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关

7、。片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区（区（virulence region）:该区段上的基因的产物为该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在。在Vir区有区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共个操纵子共24个基因。个基因。（3）Con区（区（regions encoding conjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控调控Ti质粒在农杆质粒在农杆

8、菌之间的转移。冠瘿碱能激活菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（区（origin of replication）:该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。LBRB Ti质粒介导基因转化的原理质粒介导基因转化的原理1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、如乙酰丁香酮、-羟基乙酰丁羟基乙酰丁香酮等香酮等)。2. 酚类物质诱导酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因质粒上毒性基因(vir)

9、表达表达:当根癌农杆菌接触到植物表面当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIR A蛋白传递给蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它激活其它vir 基因基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达表达Ti质粒上毒性基因质粒上毒性基因(vir)表达。表达。3. T-DNA单链分子释放：单链分子释放： virD 基因编码一种核酸内切酶，先在基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右右边缘区边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单切开另一个单

10、链缺口，使链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。以单链形式释放出来。 4. T-DNA单链分子转移到寄主细胞：单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与单链分子与vir产物产物VIR D2蛋白蛋白共价结合，并在共价结合，并在VIR D4和和VIR B蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。Ti质粒介导基因转化的原理质粒介导基因转化的原理5. T-DNA整合到植物细胞的染色体中。整合到植物细胞的染色体中。 T-DNA单链分子进入植物细胞后，单链分子进入植物细胞后，在

11、植物有关酶体系的催化下，互补的双链在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子分子,在在RB序列的引导下序列的引导下，T-DNA分子整合到植物细胞的染色体中。分子整合到植物细胞的染色体中。6. T-DNA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也被大量扩增，也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源

12、和氮源。信号受体（VIR A）酚类物质诱导信号酚类物质诱导信号VIR GRBLB转移到寄主细胞转移到寄主细胞整合到植物染色体中整合到植物染色体中T-DNA单链分子释放单链分子释放VIR G激活virB、virC、virD、virE 、virH表达VIR D植物伤口植物伤口诱导信号诱导信号信号传递信号传递诱导表达诱导表达VIR D2 、 VIR D4 、VIR B、 VIR E2等土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制酚类物质酚类物质VIR A 由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发

13、生的基因工程。一、Ti质粒的改造(一一)Ti质粒质粒1.定义定义 是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA大分子，其大小为180-240 kb。2.种类种类 2.1 根据冠瘿碱的种类不同根据冠瘿碱的种类不同 章鱼碱型章鱼碱型(octopine); 胭脂碱型胭脂碱型(nopaline);农杆碱型农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型农杆菌素碱型(agrocinopine) or琥珀碱型琥珀碱型(succinamopine)第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载

14、体的构建建(一一) Ti质粒质粒2.种类种类 2.2 根据功能区段不同根据功能区段不同 基因转移基因转移T-DNA区区 (transferred DNA region)： 与基因转移相关 毒性区毒性区,即即Vir区区 (Virulence region,Vir): 激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性的毒性区 接合转移区接合转移区 (region encoding conjuation,Con) 调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移 自我复制区自我复制区 (origin of replication,Ori) 调控Ti质粒自我复制第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的

15、构质粒基因转化载体的构建建(二二)天然天然Ti质粒存在的缺点质粒存在的缺点1.缺点缺点 野生型野生型Ti质粒分子十分巨大；质粒分子十分巨大； 野生型Ti质粒分子一般都为180-240 kb,几乎无法进行基因工程的操作，所以应去除一切不必要的大片段DNA。 限制性内切核酸酶位点众多；限制性内切核酸酶位点众多； Ti质粒是分布着各种限制性内切核酸酶，难以找到可利用的单一限制性内切核酸酶位，因此很难通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因. T-DNA区段内含有许多编码基因；区段内含有许多编码基因； 植物生长素合成酶基因,细胞分裂素合成有关酶基因等. 在大肠杆菌中不能复制。在大肠杆菌中

16、不能复制。第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建(二二)天然天然Ti质粒存在的缺点质粒存在的缺点 2.改造改造 删除T-DNA左右边界中的tms、tmr和tmt基因,即切除T-DNA中onc基因,构建所谓的“卸甲载体卸甲载体”； 引入大肠杆菌的复制起点和选择标记基因,或将Ti质粒的T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒当中,形成植物基因转化载体系统,从而使通过Ti质粒的基因重组成为可能并有利于转基因植物的筛选； 插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆和操作；第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 引入植物基因

17、的启动子和poly(A)信号序列，以确保外源基因在植物细胞内能正确高效地转录表达； 除去Ti质粒上的其他非必需序列，以最大限度地缩短载体的长度。 研究表明,大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性,因此,可以先将T-DNA的片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把外源基因引入到农杆菌的Ti质粒上. 中间载体中间载体: 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体; 受体受体Ti质粒质粒: 接受中间载体的Ti质粒.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建(三三)御甲载体御甲载体定义定义: 无毒的(non-oncogenic)Ti质粒载

18、体,又称onc-载体。 野生型Ti质粒中T-DNA中onc基因具有致瘤作用，因此,作为基因转化的载体，必须切除T-DNA中的onc基因，即解除其武装，构建成卸甲载体。在onc-卸甲载体中，已经缺失的T-DNA部位通常被大肠杆菌中的一种常用质粒pBR322取代.这样任何适于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段,都可通过pBR322质粒DNA与卸甲载体的同源重组而被共整合到onc- Ti质粒载体上.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 二、二、Ti中间表达载体的构建中间表达载体的构建中间载体 定义:是指在一个普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适的

19、T-DNA片段面构成的小型质粒。中间载体从功能上可分为两大类: 1. 克隆载体: 复制和扩增基因 2.表达载体: 适于在受体细胞中表达外源基因的载体 Ti中间表达载体结构区包括: 选择标记基因区域; 目的基因区域 每个区域由启动子、基因和终止序列组成. 二、二、Ti中间表达载体的构建中间表达载体的构建 (一一)启动子及调控序列启动子及调控序列 经由Ti质粒将外源基因整合到植物中并不一定就会发生基因的转录与表达，其先决条件在于必须要有合适的启动子和调控序列。 真核生物基因调控序列中，大多数都具有“TATA”框，位于距离转录起始点约30个核苷酸的上游区域，上游DNA的序列成分如“CAAT”(在上游

20、-80 -70bp处)也普遍存在于许多真核生物基因的启动子中。真核生物基因的3端具有AATAAA序列，从而使基因在转录过程中可以在mRNA的3端增加poly(A)的信号。第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建由AATAAA编码的mRNA序列AAUAAA的作用是发出信号，让核酸酶在此序列下游10-15bp 处切割mRNA,以便poly(A)聚合酶在切割点的3端加上100-200个腺苷酸.其作用是使mRNA的3端结合到内质网膜上,从而使3端稳定,起到保护mRNA的作用.Ca

21、MV35S启动子Ubiquitin启动子第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 二、二、Ti中间表达载体的构建中间表达载体的构建 (二二)嵌合基因的构建嵌合基因的构建嵌合基因: 来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在一起而构成的基因.完整的嵌合基因: 完整,正确的可读框,能正确表达,3端的终止信号.“植物特异性启动子+目的基因+终止子”、“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和“植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。 三、三、Ti共整合转化载体的构建共整合转化载体的构建共整合载体定义共整合载体定义 指中间载体与改造后的受

22、体Ti质粒之间,通过同源重组所产生的一种复合型载体.(一一)Ti共整合载体的特点共整合载体的特点Ti共整合载体由两个质粒组成,其中一个是E.coli质粒中间载体,另一个是御甲Ti质粒组成.农杆菌中两个质粒形成一个大的共整合载体.共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低.必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测构建是比较困难.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 三、三、Ti共整合转化载体的构建共整合转化载体的构建 (二二)Ti共整合转化载体的类型和构建策略共整合转化载体的类型和构建策略 基于中间载体与受体Ti质粒重组序

23、列的不同,共整合载体可分为以pBR322序列为同源序列的转化载体系统和基于左边界内部同源区(LIH)的转化载体系统,即SEV系统. 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略 此类载体系统的典型特点是在卸甲质粒的T-DNA区引入了pBR322,而中间载体是pBR322质粒或衍生质粒,二者之间通过同源重组实现目的基因及选择标记基因与卸甲Ti质粒的整合,进而以顺式方式将基因转化到植物细胞中去.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策

24、略中间载体导入农杆菌中间载体导入农杆菌pBR322及由其衍生的质粒为接合缺陷型,所以它们进入到农杆菌菌株中必须要有协助质粒,在协助质粒的动员下转移到农杆菌中.三亲杂交法:即将分别含有中间表达载体,协助质粒,受体质粒的菌液混合培养,在混合培养过程中,通过杂交使协助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中,然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略(2)中间载体与受体中间载体与受体Ti质粒的同源重组质粒的同源重组 pGV1103中间表达载体

25、导入农杆菌后,由于两种质粒中都带有pBR322同源序列,因此少部分质粒发生重组和交换,使少数中间载体整合到pGV3850的T-DNA区域内,形成一个大的共整合载体.没有被整合的中间表达载体由于不能在农杆菌中复制,它将会随着农杆菌的分裂增殖而自行消失.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略(3) 共整合载体的选择通过pGV3850和pGV1103质粒同源重组形成的共整合载体能够不断复制和

26、增殖,整合在Ti质粒中的中间载体随同Ti质粒得岂到复制和增值.中间载体所带有的抗性基因(Ampr,Kanr,Smr或strr)都能得到表达.此时含有共整合质粒的农杆菌将表现出中间载体携带的抗性标记,从而在含有相应抗生素的培养基上得到生长和筛选.未发生重组的pGV3850,pGV1103等均不能生长.含有共整合质粒的根癌农杆菌即可用于植物的转化.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略 (3) 共整合载体的选择整合后的Ti质粒含有重复的pBR322序列,此重复序列在农杆

27、菌转化植物细胞的过程中,与目的基因及选择标记基因一起被整合到植物染色体组上.但这种重复的序列有可造成基因的进一步重组及重排,从而影响外源基因的表达.因此,在对pGV3850系统进行改进的基础上,获得了pGV2260载体系统.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略 (3) 共整合载体的选择pGV2260系统:来自章鱼碱型Ti质粒的pTiB6S3,整个T-DNA序列连同25bp末端序列均被一段pBR322所取代。与pGV3850的区别在于pGV2260系统的中间载体必须

28、在外源基因两侧连接25bp末端序列.共整合发生后,pGV2260系统中的pBR322重复序列在25bp末端序列以外,不会随T-DNA一起整合到植物染色体中.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 2.SEV系统的构建系统的构建1985年美国孟山都公司的Fraley等建立了另一种共整合载体,即拼接末端载体(split-end vector,SEV)系统即T-DNA边界拼接系统,也因为它的两个“左边界内部同源区”(left inside homology,LIH)序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化

29、载体的构质粒基因转化载体的构建建 2.SEV系统的构建系统的构建构建过程:(1) SEV的受体Ti质粒是pTiB6S3-SE,来自野生型质粒pTiB6S3的突变体. 它的TL-DNA上的致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA的保留部分被称为LIH,即左边界内部同源序列.该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其他正常的功能基因,同时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因(Kanr).第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建(2)SEV中间载体是pMON200. 它含有一个胭脂碱合成酶基因,一个在细菌里编码的壮观霉素抗性基因(Sper),链霉素抗性基因(St

30、rr)及在植物中作选择标记基因的新霉素磷酸转移酶基因(Npt ).此外,它还含有一个多克隆位点(MCS),可以方便地插入外源基因.更为重要的是它具有与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR.从pMON200衍生出的一个新的质粒pCIT30具有更理想的特性. 质粒pCIT30中,潮霉素抗性基因(Hygr)代替了MMiI基因,并且引入了一个cos位点和多克隆位点.在噬菌体包装系统中可在cos位点上插入25-40kb的植物DNA,不需要额外的亚克隆步骤.多克隆位点上具有克隆和释放插入DNA所需要的限制酶酶切位点。该载体还具有T7和S6细菌噬菌体启动子，它们用于转录染色体步移中的末端特异性RNA探针.第一

31、节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建(3) 通过三亲杂交将中间载体pMON200或pCIT30导入农杆菌后,由于它之间都具有LIH同源序列,即可发生同源重组,形成SEV的共整合载体.SEV包含有分别来自两个质粒的左右边界及Vir基因,成为一个完整的非致瘤性Ti质粒.由于中间载体带有抗性嵌合基因,因而转化的植物可以直接进行筛选.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 (3)SEV系统与系统与pGV3850系统的比较系统的比较相同点: 两者都是通过受全Ti质粒与中间载体同源重组而形成的,故同属于共整合载体.不同点

32、: 它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同. pGV3850的左右边界(TL,TR)在一个受体Ti质粒上,而SEV来自两个质粒,即TR来自中间载体. 同源序列不同. pGV3850重组的同源序列是pBR322,而SEV是LIH. SEV是更有效的共整合载体. pGV3850共整合载体转化的植物中也带有重复的pBR322序列.此重得序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响,而SEV系则排除了这种可能,所以更为有效.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 四、四、TiTi双元转化载体的构建双元转化载体的构建双元载体双元载体(binary vector

33、)(binary vector)定义定义: :是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统.由于T-DNA与Vir基因分别位于两个独立的质粒上,Vir基因是通过反式激活的方式促成T-DNA的转移,故称为反式载体.通常含有T-DNA序列的穿梭载体用于携带嵌合基因,而含Vir基因的Ti质粒作为辅助质粒激活T-DNA的转移。第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建 (一一) Ti双元转化载体系统的构建原理双元转化载体系统的构建原理Ti质粒上的vir基因与T-DNA具有反式互补作用,即Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。根据这一

34、原理可以使T-DNA与Vir区处于不同复制子或不同的Ti质粒上,同样可以激活T-DNA转移,使插入到T-DNA区的外源基因导入植物细胞中;双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点(ori),从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区.它能够在任何农杆菌寄主里自发复制,这意味着所有的农杆菌菌株不论带有Ti质粒还是Ri质粒,不论它是武装的，还是解除武装的，都能导入中间表达载体而成为双元表达载体，寄主仅需要提供一套完整的Vir基因.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 (二二)Ti双元转化载体系统的特点双元转化载体系统的特点由两个彼此相容的Ti质粒组成：

35、1.转移载体质粒 是T-DNA缺失的突变型质粒,类似于共整合表达系统中的卸甲质粒。 2.穿梭质粒第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建穿梭质粒的特点：(1)具有PK2质粒的复制功能，可以在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制，并且与Ti质粒是相容的;(2)具有Ti质粒的左右两侧或右侧的边缘区序列，使DNA可以转移到植物细胞；(3)边缘区序列内包含植物选择标记嵌合基因，用于转基因阳性株的初步筛选；(4) 带有抗生素基因,一般是Kanr基因,可以作为细菌转化子的选择记号第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建 (三三)共整

36、合载体系统与双元表达载体系统的比较共整合载体系统与双元表达载体系统的比较 两个系统在构建思路上,一个是应用了Vir基因对T-DNA的顺式作用,一个是应用了反式调控,二者之间存在较大的差异.(1) 双元表达载体构建简单;双元表达载体具有双复制位点;双元表达载体的接合频率更高;双元表达载体在鉴定上更为容易;(2) 双元表达载体的稳定性不如共整合载体.第二节第二节 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)与根癌农杆菌(A.tumefaciens)同属，但发根农杆菌侵染植物细胞后，会被其Ri质粒诱导产生类似于不定

37、根的毛发状物。发根农杆菌侵染植物后,会诱使植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分支成毛状，故称毛状根，也称发状根，而Ri质粒为根诱导质粒.第二节第二节 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建 与根癌农杆菌的Ti质粒相比,Ri质粒的转化具有许多优点： 可以不经解除武装进行转化，并且转化产生的发状根能够再生； 发状根是一个单细胞克隆，可发避免产生嵌合体； 可直接作中间载体； 发状根适于进行离体培养，而且很多植物的发状根在离体培养条件下都表现出原植株次生代谢产物的合成能力。因此，Ri质粒不仅可作为转化的优良载体，而能应用于有价值的次生代谢物的生产。第二节第二

38、节 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建一、一、Ri质粒的基因结构质粒的基因结构Ri质粒与Ti质粒一样属于巨大质粒,Ri质粒的大小为200-800kb,并且在一种菌株之间可能存在着多种质粒. Ri质粒也可划分为T区,Vir区,ori区和其它区域等.Ri质粒的分类:Ri质粒转化的植物细胞可合成一类特殊的氨基酸衍生物 冠瘿碱，这些冠瘿碱的合成酶基因位于TDNA 上在真核细胞中由于存在有活性的冠瘿碱基目的启动子，所以这些冠瘿碱基因可在真核细胞中表达。目前，已在Ri质粒转化的植物细胞中发现了多种类型的冠瘿碱：农杆碱、甘露碱、黄m碱和农杆碱酸、甘露碱酸、农杆碱素AD，根据

39、合成的冠瘿碱种类的不同，可将Ri质粒分成农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。第二节第二节 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建Ri质粒上与转化有关的区域有Vir区(致病区)和T区(转移区)。Vir区距TDNA35kb，长约20kb 在TDNA 的转移过程中Vir区基因并不转移，但该区域的缺失或突变将导致致病能力的减弱或丧失，使被感染的植株不出现具有重要的作用。通过对Vir区核昔酸序列分析表明3种类型Ri磺粒的Vir区具有很高的保守性而且与Ti质粒的Vir区同源农杆碱型 质粒的T 区可分为T 区和T 区，相应的DNA 分别称之为T 一DNA 和T DNA。T 区与T 区

40、是间断的两区之间是大约1 5kb的非转移DNA 甘露碱型Ri质粒和黄瓜碱型鼬质粒的T区则都只有一段单一的长约20kb的连续T DNA 3种Ri质粒TDNA两端各有一段与Ti质粒TDNA左右边界序列具有很强同源性的25bp重复序列.第二节第二节 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建二、二、Ri中间表达载体的构建中间表达载体的构建 Ri质粒的T-DNA上的基因只是诱导植物产生不定根,并不影响植株再生,因此,野生的Ri质粒可以直接作为转化载体,也就是说不需要“卸甲”过程。Ri转化系统中间载体的构建与Ti转化中间表达载体的构建相同.第二节第二节 发根农杆菌发根农杆菌Ri

41、质粒基因转化载体的构质粒基因转化载体的构建建三、Ri共整合转化载体的构建在Ri共整合转化载体的构建过程中,中间载体常用Pbr322,pBI21及Pcam-BIA系列等.把目的基因插入到T-DNA中，构成中间表达载体。然后通过诱导菌株的协助质粒和野生型的发根农杆菌直接进行三亲杂交，通过同源重组把中间载体整合到Ri质粒的T-DNA中,即构建成带有目的基因的共整合载体,它和Ti质粒的共整合载体唯一不同之处是可直接利用野生型的Ri质粒.第二节第二节 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的质粒基因转化载体的构建构建四、四、Ri双元转化载体的构建双元转化载体的构建Ri质粒双元载体的转化策略及其构建程序

42、基本和Ti质粒相同.原理主要是Ri质粒的Vir基因在反式条件下同样能驱动T-DNA转移，即Vir基因和T-DNA分别在两个Ri质粒上同样能执行上述功能.第三节第三节 载体构建中常用的选择标记基因和载体构建中常用的选择标记基因和报告基因报告基因如何选择和筛选转化体，同样是一个重要的问题。科学家们一直试图在转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。 选择标记基因选择标记基因和筛选标记基因筛选标记基因（又称报告基因报告基因）在功能和性质上有一定的差异。 选择标记基因选择标记基因是：该基因的产物赋予植物细胞某种抵抗选择压力的能力，使转化细胞能够正常生长发育，未转化的细胞则不能甚至死亡，从而将转化细胞选择

43、出来。筛选标记基因筛选标记基因则强调给转化细胞带上一种标记，起报告或识别的作用，故也称为报告基因报告基因(如如GUS基因、基因、GFP基因）。基因）。 作为一种标记基因作为一种标记基因(不论是选择标记基因还是筛选标不论是选择标记基因还是筛选标记基因记基因)，都必须具备以下四个条件：，都必须具备以下四个条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶； 基因较小，可构成嵌合基因；基因较小，可构成嵌合基因； 能在转化细胞中充分表达；能在转化细胞中充分表达； 检测容易，并能定量分析。检测容易，并能定量分析。 下面对一些常用的选择基因或报告基因进行介绍：下面对一些常用的选

44、择基因或报告基因进行介绍： （一）选择（标记）基因（一）选择（标记）基因 1、新霉素磷酸转移酶基因（、新霉素磷酸转移酶基因（npt ）npt 基因又称氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，最初是从细菌的转座子基因又称氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，最初是从细菌的转座子Tn5中分离得到，其表达产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶通过磷酸化使抗生素失活，从中分离得到，其表达产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶通过磷酸化使抗生素失活，从而解除抗生素的毒性。而解除抗生素的毒性。 npt 基因是目前植物遗传转化中应用最广泛的选择标记基因，其适用的抗基因是目前植物遗传转化中应用最广泛的选择标记基因，其适用的抗生素种类为卡那霉素、庆大霉素和

45、生素种类为卡那霉素、庆大霉素和G418等。等。未转化的草莓外植体未转化的草莓外植体 转化的草莓外植体转化的草莓外植体 2、潮霉素磷酸转移酶基因（、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt） 潮霉素对许多种植物都会产生很强的毒性。细菌中存在的潮霉素磷酸转移酶基因的产潮霉素对许多种植物都会产生很强的毒性。细菌中存在的潮霉素磷酸转移酶基因的产物物潮霉素磷酸转移酶可通过酶促磷酸化作用使潮霉素失活，从而产生对潮霉素的抗性。潮霉素磷酸转移酶可通过酶促磷酸化作用使潮霉素失活，从而产生对潮霉素的抗性。 对某些用卡那霉素不能进行有效选择的植物（如拟南芥），通过导入该基因并使用潮对某些用卡那霉素不能进行有效选择的植物（如拟南

46、芥），通过导入该基因并使用潮霉素作选择剂，效果相当明显。霉素作选择剂，效果相当明显。3、氯霉素乙酰转移酶基因（、氯霉素乙酰转移酶基因（cat） 将将cat基因作为选择标记基因导入植物后，转化细胞得到抗氯基因作为选择标记基因导入植物后，转化细胞得到抗氯霉素的特性。霉素的特性。4、其它选择标记、其它选择标记 除上述选择标记外，还有许多选择标记基因可供利用，尤其是除上述选择标记外，还有许多选择标记基因可供利用，尤其是抗除草剂基因抗除草剂基因(非抗生素素基因非抗生素素基因)，在研究中使用逐渐增多。，在研究中使用逐渐增多。 （二）报告基因（二）报告基因 报告基因（报告基因（reporter gene）通

47、常是指在转化系统中通过其表）通常是指在转化系统中通过其表达来确定是否转化成功的一类基因，它起到报告（而非选择）的作达来确定是否转化成功的一类基因，它起到报告（而非选择）的作用，故称为报告基因。用，故称为报告基因。 理论上讲，经过选择培养后存活的细胞及其再生植株均应是转理论上讲，经过选择培养后存活的细胞及其再生植株均应是转基因的，但实际上，由于种种原因，其中仍可能大量存在着嵌合体、基因的，但实际上，由于种种原因，其中仍可能大量存在着嵌合体、假转化体和自发突变产生的抗性突变体。因此，对经过选择后的细假转化体和自发突变产生的抗性突变体。因此，对经过选择后的细胞仍要进一步筛选，确定其为真正的转基因个体

48、。胞仍要进一步筛选，确定其为真正的转基因个体。 理想的报告基因应该具备以下条件：其产物在原植物中不存在或理想的报告基因应该具备以下条件：其产物在原植物中不存在或本底很低，而且对宿主植物细胞无毒性；表达产物应有适度的稳定本底很低，而且对宿主植物细胞无毒性；表达产物应有适度的稳定性以利于检测；检测方法应简单、灵敏并可以进行定量。常用的报性以利于检测；检测方法应简单、灵敏并可以进行定量。常用的报告基因如下：告基因如下：1、-葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（gus）gus基因是广泛应用的报告基因，它在植物细胞中产生葡萄糖苷酸酶，在一定条件基因是广泛应用的报告基因，它在植物细胞中产生葡萄糖苷酸酶，在一定

49、条件下催化下催化X-Glucuionic acid(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯)底物，产生底物，产生蓝色沉淀；另蓝色沉淀；另外，另一种底物外，另一种底物4-MUG（4-甲基甲基-伞形花酮伞形花酮-D-葡萄糖苷酸酯）在葡萄糖苷酸酯）在GUS作用下形成作用下形成4-MU（4-甲基伞形花酮），后者在甲基伞形花酮），后者在365nm光下激发产生的荧光，可用荧光光谱法检测。这种光下激发产生的荧光，可用荧光光谱法检测。这种方法的检测容易，成本低廉，故被广泛使用。方法的检测容易，成本低廉，故被广泛使用。常用的报告基因常用的报告基因-葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（gus）绿色

50、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因（gfp）冠瘿碱（冠瘿碱（opine）合成酶基因）合成酶基因花青素合成有关的基因花青素合成有关的基因转基因烟草植株的转基因烟草植株的GUS组织化学染色结果组织化学染色结果A-D，pAAP2:GUS、p35S-AAP2:GUS和和p35S:GUS转基因烟草植株转基因烟草植株的根、茎、叶和花的的根、茎、叶和花的GUS组织化学染色结果。组织化学染色结果。E，在，在萌发的萌发的T1幼苗中也观察到幼苗中也观察到了相似的了相似的GUS染色结果。染色结果。WT，野生型对照烟草植，野生型对照烟草植株；株；AAP2，转化，转化pAAP2: GUS载体的转基因烟草植载体的转基因烟草植株；株；35S-AAP2，转化，转化p35S-AAP2:GUS载体的转载体的转基因烟草植株；基因烟草植株；35S，转化，转化p35S:GUS载体的转基因烟载体的转基因烟草植株。草植株。根根茎茎叶叶花花萌发的萌发的T1幼苗幼苗棉花子房、胚珠及种子特异启动子调控表达的棉花子房、胚珠及种子特异启动子