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1、 reporter：Single-molecule analysis ofRAG-mediated V(D)J DNA cleavagePNAS 2015 112 (14) 4193-4194; doi:10.1073/pnas.ss11214 背景知识 2 V(D)J Recombination1 1Recombination Activating Gene2 2 High Mobility Group Box-1 Protein3 34 4 Tethered particle motion背景知识 3 V(D)J重组重组V(D)J RecombinationV（D）J代表可变区V，多样区D

2、，连接区J。重组是在T和B细胞成熟的早期阶段仅发生在淋巴细胞中的基因重组的独特机制。它是B和T细胞上发现的免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）的高度多样性的组成部分。V（D）J重组负责组装在B和T淋巴细胞发育期间抗原受体的可变区。 在V（D）J重组期间，同时位于特定染色体上的V，D和J片段被重排到功能性V（D）J或者有特异性决定簇的B细胞受体或免疫球蛋白（Ig）和 T细胞受体（TCR）VJ等位基因中。 与V，D和J基因区段相邻的是由高度保守的七聚体（共有序列5-CACAGTG-3）和九聚体（共有序列5-ACAAAAACC-3）组成的重组信号序列（RSS），被相对不保守的间隔序列12bp 或

3、23bp（分别称为12RSS和23RSS）分开。背景知识 4 重组激活基因（RAG）是在编码免疫球蛋白和T细胞受体分子的基因的重排和重组中起重要作用的酶。它有两种称为RAG-1和RAG-2的重组激活基因产物，其细胞表达在其发育阶段限于淋巴细胞。RAG-1和RAG-2对于产生成熟B和T淋巴细胞是两种细胞类型是必需的。RAGRecombination activating gene RAG蛋白启动V（D）J重组，这是pre-B和pre-T细胞的成熟所必需的。 研究表明RAG-1和RAG-2必须以协同方式工作以激活VDJ重组。当分离和转染成纤维细胞样品时，显示RAG-1低效诱导VDJ基因的重组活性。

4、当RAG-1与RAG-2共转染时，重组频率增加了1000倍，这一发现促进了新修订的理论，RAG基因不仅可以帮助VDJ重组，而是直接诱导VDJ基因的重组。背景知识 5 高迁移率族蛋白是存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)中迁移速度快而得名。HMGB1是一个含有215个氨基酸残基的单链多肽，高度保守，N端富含带正电荷的赖氨酸，C末端富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸，又称酸性尾巴，分子量约为24894 Da。从氨基端到羧基端的结构依次为A box，B box和仅含谷氨酸和天冬氨酸残基的受体结合模体。HMGB1High Mobility Group Box-1

5、 Protein 其中B box是发挥炎症的功能区域，A box是B box的拮抗位点。A box和B box都能够与DNA结合，并参与DNA双链的折叠与扭曲。HMGB1背景知识 6 Tethered particle motionTPMTethered particle motion (TPM)是用生物物理方法研究各种聚合物如DNA及其与其他物质（例如蛋白质）的相互作用。TPM - 聚合物的一端连接到小珠（几十到几百纳米），而另一端连接到表面。聚合物和珠保持在水性环境中，因此珠以布朗运动移动。由于系绳，运动受到限制。TPM是单分子实验方法。 7 结果fig.1 8 结果fig.2 These

6、 experiments provide a quantitative picture of the stages leading up to DNA cleavage during V(D)J recombination and reveal the dynamic nature of the paired complex. 9 fig.3As such, we interpret these periods of reduced rms motion to be binding events that change the effective tether length by 64 5 b

7、p for a single 12RSS binding site and 57 5 bp for a single 23RSS binding site 5 nM RAG1/2c-the red line is the rms trajectory of the bead and the black dashed line is the resulting segmentation between long and short states of the DNA tether.Detecting Single RAGRSS Complexes in Real Time. 10 结果fig.4

8、 475 5 bp 482 5 bp Establish the length of time that a molecule of RAG1/2c stays bound on a DNA molecule before dissociating.With a 430 120 s dwell time when bound to a 12RSS (black circles) and a dwell time of 230 80 s on a 23RSS (red circles). 11 结果fig.5HMGB1 Alters the Binding Properties of RAGRS

9、S Complexes. 12 结果We observe that HMGB1 alters the reduction in DNA tether length for RAG1/2c alone from 64 5 bp and 57 5 bp for a single 12RSS and 23RSS to 101 8 bp and 132 4 bp, respectively. 13 结果fig.6Direct Observation of Paired Complex Formation. In the presence of 5 nM RAG1/2c and 80 nM HMGB1

10、for 1 h。2900bp Display distinctly different DNA lengths of 1,360 bp for the 1,200-bp intersignal substrate and 880 bp for the 1,800-bp intersignal substrate 14 结果C(i) paired complex formation and excision of the looped DNA faster than we can resolve with our method (ii) a pathway for cutting that do

11、es not require the two RSS sites to synapse 15 结果fig.7Dynamics of 12/23 Rule-Regulated Bead Release as a Function of RAG1/2c and HMGB1. 16 结果 17 结果fig.8 18 讨论结合动力学显示RAG-RSS复合物的平均停留时间。实时检测单个RAG-RSS复合物。HMGB1改变RAG-RSS复合物的结合性质。直接观察平行复合物形成。12/23规则调节珠释放作为RAG1 / 2c和HMGB1的函数的动力学。 19 讨论 我们观察到在没有HMGB1的情况下通过RA

12、G的RSS结合的DNA长度的明显减少，这与先前的工作一致，显示单独的RAG蛋白在RSS处弯曲DNA。这种计算提供了RAG-RSS交互的Kd。我们期望，我们的单分子方法可用于测量非共有RSS的Kd值，从而提供对RSS和RAG活性之间的关系的更完整的理解。 该方法还允许首先测定RAG1 / 2c复合物结合到12RSS或23RSS的平均停留时间。 我们发现RAG1 / 2c-RSS复合物是相当稳定的，停留时间在几分钟的量级。 特别地是，我们发现，与23RSS（230s）相比，复合物在12RSS（430s）处保持更长的结合时间，与两个位点之间的Kd的差异一致; 20 讨论 我们发现HMGB1增加RAG

13、-RSS复合物中DNA长度的减少量。 这种观察结果与在12RSS-RAG-HMGB1或23RSS-RAG-HMGB1复合物中检测到的大弯曲的HMGB1依赖性一致，尽管那些研究使用短的寡核苷酸底物。 我们还使用这种DNA链系长度的减少量来确定在RAG1 / 2c和HMGB1存在下12RSS和23RSS的Kd，并且发现HMGB1与单独的RAG1 / 2c相比降低了两个Kd值，并且它们是相似的，与前面的观察一致。我们研究HMGB1依赖过程的单分子实验可以扩展到研究除RAG1 / 2c以外的其它可以与DNA结合并且可以被HMGB1促进的蛋白质（例如，肿瘤抑制蛋白p53）。 21 讨论 在我们实验中使用

14、的RAG1 / 2c和HMGB1的浓度下，在HMGB1存在（或不存在）下与RAG1 / 2c相关的结合事件相对频繁，但是该结合（配对复合物形成）的下游产物相对稀少 ; 在我们的实验中，珠子结合到DNA上在配对的复合物状态中仅花费总观察时间的4。 我们直接观察到在DNA底物上存在12RSS和23RSS时配对复合物的形成。 当仅存在12RSS（或不存在RSS）时，我们没有看到复合物形成的证据，并且我们确认当使用1,200和1,800-bp间距时配对复合物时的表观长度与已经被缩短了12/23的信号间距的系链一致。我们无法确定是否一个或两个RSSs在配对的复杂形成之前被占领， 我们需要进行更多的研究来解决这个重要机制问题。 22 讨论 最后，我们通过观察珠子释放推断发夹结构的形成作为研究RAG-HMGB1-RSS介导的DNA上的切割。在这些实验中，我们证实了珠释放和RAG1 / 2c和