生物：中图版选修一酶的制备及活力测定（课件）

1、3.1 3.1 酶的制备及活力测定酶的制备及活力测定实验目的和要求1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。辣根过氧化物酶的制备及活力测定辣根过氧化物酶的制备及活力测定过氧化物酶催化以下反应 2H 2 O 2 O 2 +2H 2 O 这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类 (hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP，是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验

2、是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质 ,Mr在40 000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E 0 =-0.2070V，pH为7.71时，E 0 =-0.2787V。 1.RZ值：提纯工作的后几步，以及纯酶溶液可用RZ值表明酶

3、的纯度。RZ= A403nm/A275nm，403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL。 2.愈创木酚法：测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度有关。 本实验是采用测定 k4的方法来判断酶的纯度。一、 HRP的制备 1.水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎12次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采

4、用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。 2.硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1 000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0. 40饱和度，0)，大约在12h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3 000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13 000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100

5、150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析12天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换23次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液的体积。 3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至15的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)15丙酮，(操作同上)，静置后，

6、在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L，5 000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。 二、 HRP的活力测定 1.活力测定：测定k4值的方法操作如下：取2个比色池(带盖，光程1cm)，按表加入反应物。对照样品反应物磷酸盐缓冲液2.91

7、mL 2.90mL 愈创木酚溶液0.05mL 0.05mL 酶液0.0mL0.01mL酶液：将1mg蛋白/mL的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。 加好反应物，摇匀，在 470nm读出A470nm值，为t=0时的读数。立即加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30s读数1次，约5min，并记下实验时的室温。 将所测样品的 A470nm值减去相应时间对照的A470nm值，然后以A470nm值为纵坐标，时间为横坐标作图，得一直线，计算出平均每分钟光吸收的增加，即求出x/t，按公式(8)求出k4值。或不求k4值，而把在上述条件下，每分钟A470nm增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。 2.蛋白质含量的测定：将酶液适当稀释后，用Bradford法比色测定蛋白质含量， 1.计算产品