教学课程药物分析课程的——抗生素类药物的分析

1、会计学1教学课程药物分析课程的教学课程药物分析课程的抗生素类抗生素类药物的分析药物的分析思考与练习第一节 概 述第二节 内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素第四节第四节 四环素类抗生素四环素类抗生素第五节 抗生素类药物中高分 子杂质的检查基本要求基本要求基本要求基本要求一、掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法一、掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。之间的关系。二、掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。二、掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。三、掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原三、掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算。理、测定方

2、法与计算。四、熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。四、熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。返返 回回第一节第一节 概述概述1. 抗生素药物的特点抗生素药物的特点化学纯度较低化学纯度较低活性组分易发生变异活性组分易发生变异稳定性差稳定性差2. 微生物学法与理化法的比较微生物学法与理化法的比较微生物检定法微生物检定法理化法理化法以抗生素对微生物的杀伤或抑制程以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标衡量抗生素的生物效价度为指标衡量抗生素的生物效价 根据抗生素结构特点，利用其根据抗生素结构特点，利用其特有的理化性质测定其含量特有的理

3、化性质测定其含量已知或新发现的抗生素、精致品或已知或新发现的抗生素、精致品或粗制品均能测定粗制品均能测定 测定化学结构已知、已提纯的测定化学结构已知、已提纯的抗生素抗生素灵敏度高、样品需用量小、反映抗灵敏度高、样品需用量小、反映抗生素的医疗价值，但操作步骤多、生素的医疗价值，但操作步骤多、费时、费时、误差大误差大 迅速、准确、专属性高、样品迅速、准确、专属性高、样品需用量小、操作简单、省时需用量小、操作简单、省时3.3.抗生素的活性以效价单位来表示：抗生素的活性以效价单位来表示： 每每mlml或每或每mgmg中含有某种抗生素的有效成中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位（分的多少，用单位（u

4、 u）或）或g g 表示。表示。 1 1mgmg青霉素青霉素G G钠盐定为钠盐定为16671667单位单位 1 1mgmg青霉素青霉素G G钾盐的单位（钾盐的单位（u u） =1667=1667356.4/372.5=1595u/mg356.4/372.5=1595u/mg分类分类（按结构与性质）：（按结构与性质）： 内酰胺类、氨基糖苷类、内酰胺类、氨基糖苷类、 四环素类、大环内酯类、四环素类、大环内酯类、 氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类林可霉素类、其他抗生素类返返 回回第二节第二节 内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 青霉素类青霉素类NSCH3CH3

5、COOHOHN1234567RCO母核（母核（6-6-氨基青霉烷酸）氨基青霉烷酸）AB头孢菌素类头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCOABCONSOHNCOOHCH3CH3CH2（青霉素钾、钠）（青霉素钾、钠）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素头孢氨苄头孢氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2CH2NH2CONONHSCH3COOHNONHSCH3COOHOCNH2CH2HO头孢

6、噻吩钠头孢噻吩钠SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONaNSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性酸性结构特点与性质结构特点与性质NaNa与碱金属与碱金属(Na(Na+ +、K K+ +) )成盐成盐 （一）羧基（一）羧基 易溶于水易溶于水 与有机碱与有机碱( (普鲁卡因普鲁卡因) )成盐成盐 难溶于水难溶于水普鲁卡因普鲁卡因青霉素青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO123456787654321NOS头孢菌素类头孢菌素类 C6 C7青霉素类青霉素类 C3 C5 C6 旋光性旋光性 NSO头孢菌素类头孢菌素类 母核有共轭体系母核有

7、共轭体系 青霉素类青霉素类 母核无明显母核无明显UVUV 多数有苯环取代基多数有苯环取代基 NOS UVUV水溶液水溶液 不稳定不稳定 干燥纯净干燥纯净 稳定稳定 不稳定不稳定性因素性因素四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰胺键易水解 青霉素类青霉素类 某些氧化剂某些氧化剂酸、碱、青霉素酶酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（某些金属离子） （温度）（温度）降解降解失效失效例例青霉素的降解反应青霉素的降解反应青青霉霉素素青霉噻唑酸青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉素酶青霉酸青霉酸H2OpH2100青霉噻唑青霉噻唑酰基羟胺酸酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸青霉烯酸pH4青霉胺青霉胺CO2青霉醛青霉醛

8、HgCl2头孢菌素类头孢菌素类酸、碱、胺类酸、碱、胺类 -内酰胺酶内酰胺酶降解降解失效失效（一）呈色反应（一）呈色反应1. 1. 羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应-内酰胺类内酰胺类呈色呈色羟肟酸衍生物羟肟酸衍生物Fe3+/3H+鉴别试验鉴别试验 二、二、NaOH2 2HClNOHH- - 内酰胺类内酰胺类NSONSCOHNHOHH2NOH HClNSCHNHOFe3+3OH+Fe3+/3 （红、棕、褐）（红、棕、褐）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH22. 茚三酮茚三酮反应反应 - -氨基氨基 -氨基氨基茚三酮茚三酮 蓝紫色蓝紫色3. 双缩脲反应双缩脲反应- - -CONH（开环分解）（开环

9、分解） - 内酰胺类内酰胺类碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜紫紫4. 与重氮苯磺酸反应与重氮苯磺酸反应橙黄色橙黄色重氮苯磺酸重氮苯磺酸- - -5 56 6OHHC（偶合）（偶合）酚羟基酚羟基头孢哌酮头孢哌酮5. 与变色酸与变色酸- -硫酸反应硫酸反应活泼活泼“-CH2-”青霉素青霉素阿莫西林阿莫西林氨苄西林氨苄西林HCHOCHSOH- - - 2 22 2”羰基侧链含“羰基侧链含“（分解分解）变色酸变色酸显色显色1. K+、Na+的火焰反应的火焰反应（二）各种盐的反应（二）各种盐的反应 焰色焰色鲜黄色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+ 焰色焰色紫色紫色 + 0.1%四苯硼钠四苯硼钠 + A

10、c白白 K+2. 沉淀反应（青霉素盐）沉淀反应（青霉素盐）遇酸遇酸白白青霉素青霉素青霉素钠青霉素钠青霉素钾青霉素钾緘緘+ +H3. 重氮化重氮化 - - 偶合反应偶合反应 青霉素青霉素普鲁卡因普鲁卡因普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素+ + + +H重氮化重氮化-偶合反应偶合反应红红 芳伯氨基芳伯氨基4. 与三硝基苯酚反应与三硝基苯酚反应 三硝基苯酚三硝基苯酚二苄基乙二胺二苄基乙二胺苄星青霉素苄星青霉素NaOH二苄基乙二胺二苄基乙二胺三硝基苯酚三硝基苯酚H2OHOH-HCONSOHNCOOHCH3CH3CH2CH2NCH2CH2NHCH2OHNO2O2NNO2CH2NCH2CH2NHCH2光谱法光谱

11、法（三）（三）1、 UV法法样品、分解产物样品、分解产物nm339HA + +苯唑青霉烯酸苯唑青霉烯酸苯唑青霉素苯唑青霉素Cu2+A,Emin,max,%1cm1 光光谱谱图图头孢氨苄头孢氨苄 max = 262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A264nm = 1.301.50NOCONHCH3NOSCH3CH3COONaNOCHCH3OCOCNHNCHHCCH3CH3SHCHCOOHpH3.8分子重排分子重排2、IR法法3180cm-1 N-H内酰胺内酰胺 C=O1780cm-13470cm-1 O-H1690cm-1仲酰胺仲酰胺 C=O1250cm-1 C-O以阿莫西林为例以阿莫西林

12、为例色谱法色谱法（四）（四）1、 TLC法法对照品对照法对照品对照法和斑点颜色和斑点颜色比较比较供试品供试品对照品对照品相同条件相同条件fR2、 HPLC法法Rt比较比较供试品供试品对照品对照品相同条件相同条件三、杂质检查三、杂质检查 药物药物 检查项目检查项目 检查方法检查方法 头孢他啶头孢他啶 聚合物聚合物 HPLCHPLC法法 头孢曲松钠头孢曲松钠 头孢哌酮钠头孢哌酮钠 头孢噻肟钠头孢噻肟钠 头孢呋辛酯头孢呋辛酯 有关物质和异构体有关物质和异构体 HPLCHPLC法法 头孢氨苄头孢氨苄 有关物质有关物质 反相反相TLCTLC法法 青霉素钾（钠）青霉素钾（钠） 吸收度吸收度 紫外分光光度法

13、紫外分光光度法 1. 1.头孢他啶聚合物的测定头孢他啶聚合物的测定 固定相：葡聚糖凝胶固定相：葡聚糖凝胶G-10G-10（ 4012040120m m ） 流动相流动相A A：3.5%3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 流动相流动相B B：0.01%0.01%十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 对照品溶液：头孢他啶对照品对照品溶液：头孢他啶对照品 100100g/mlg/ml1 1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用用1mg/ml1mg/ml蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖20002000、流动相、流动相A A测定；重测

14、定；重复性用对照品溶液、流动相复性用对照品溶液、流动相B B测定。测定。 N N不低于不低于900900，拖尾因子，拖尾因子0.0.751.5.5，峰面积的，峰面积的RSDRSD应小于应小于5.0%5.0%。2 2）测定方法）测定方法 进样供试液，用流动相进样供试液，用流动相A A；进样对照液，；进样对照液，用流动相用流动相B B。以外标法计算，含头孢他啶聚合。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过物以头孢他啶计不得超过0.3%0.3%。2.2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：固定相：ODSODS 流动相：流动相：0.2mol/L0.2

15、mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵- -甲醇（甲醇（62:3862:38） 1 1）头孢呋辛酯）头孢呋辛酯2 2- -异构体的制备：头孢呋辛酯对异构体的制备：头孢呋辛酯对 照品照品+ +流动相流动相 头孢呋辛酯头孢呋辛酯2 2- -异构体。异构体。2 2）系统适用性试验：各异构体之间的）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5R1.5，以，以 头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A异构体计算异构体计算n1500n1500。3.3.头孢氨苄中有关物质的检查头孢氨苄中有关物质的检查-反相反相TLCTLC法法 固定相：活化后的硅胶固定相：活化后的硅胶G G板置板置5%5%（V/VV/V）正十四）正十四 烷的正己烷溶液

16、中，展至顶部，凉干烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂：展开剂：0.1mol/L0.1mol/L枸橼酸枸橼酸-0.2mol/L-0.2mol/L磷酸氢二磷酸氢二 钠钠- -丙酮（丙酮（120120：8080：3 3） 供试液：本品供试液：本品 50mg/ml 50mg/ml 对照液（对照液（1 1）：本品）：本品 0.5 mg/ml0.5 mg/ml 对照液（对照液（2 2）：）：-苯甘氨酸苯甘氨酸 0.5 mg/ml0.5 mg/ml 对照液（对照液（3 3）：）：7-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml0.5 mg/ml结果判断结果判断：供试液如显杂质斑

17、点，与对：供试液如显杂质斑点，与对照液（照液（2 2）（）（3 3）位置相同上所的斑点比）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液（点，与对照液（1 1）所显的主斑点比较，）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。其颜色不得更深。4.4.青霉素钠（钾）的吸收度检查：青霉素钠（钾）的吸收度检查： 供试液供试液 1.80mg/ml1.80mg/ml， 结果判断：结果判断：A A280280不得大于不得大于0.100.10- -8 8I2 2 I+ +H碘量法碘量法（一一）1. 原理原理水解产物水解产物6 6 2 2 2 22 22 22 2O

18、SNaNaIOSNaI定量过量定量过量剩余剩余ChP四、含量测定四、含量测定（水解水解）NaOH头孢菌素族头孢菌素族青霉素族青霉素族反应分两步进行：反应分两步进行：1. 1. 水解反应水解反应( (按化学计算量进行按化学计算量进行) )2. 2. 氧化氧化- -还原反应还原反应( (无固定的量关无固定的量关系，受温度、系，受温度、PHPH值和时间等因素值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定用标准品平行对照测定) )NSCH3CH3COOHOHNRCORCOHHNCOONaCH3CH3SNCOONaI24+ 5H2O+ 2HClNaOHCCH3

19、CH3SO3HCHNH2COOHCHNHCORCOOH2+2NaCl+8HI第一步第一步第二步第二步V样空样空V样样对照液对照液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 V对空对空V对对2. 方法方法供试液供试液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 空白试验空白试验A、消除样品已降解产物的干扰消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰质的干扰C、消除碘挥发造成的误差消除碘挥发造成的误差 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定空白空白样品样品I2Na2S2

20、O3I-I2 采用标准品平行对照测定采用标准品平行对照测定A、可消除温度、可消除温度、pHpH、操作、环、操作、环 境等条件的影响境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定使本法测定结果与微生物检定 法一致法一致3. 条件条件（1）弱酸性弱酸性 pH4.5碱碱 I2 IO3- + I-酸酸 普鲁卡因与碘在酸性条件普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀下会产生复盐沉淀（2）温度温度 2426温度温度38 未水解的供试品亦消耗碘未水解的供试品亦消耗碘（3）水解时间水解时间以水解以水解2020分钟后的分钟后的耗碘量最大耗碘量最大（4）反应时间反应时间反应反应2020分钟后，分钟后，耗碘量随时间的

21、耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误变化较小，可减小含量测定的误差。差。4. 特点特点（1）灵敏度高灵敏度高样品样品 : 碘碘 = 1 : 8（2）反应条件、实验操作要求高反应条件、实验操作要求高V对对、V对空对空V样样、V样空样空1份含量份含量加试剂次序、反应时间、滴定速度相同加试剂次序、反应时间、滴定速度相同4I28I-5. 计算计算原料原料%WWVVVV对照品对照品）（）（含量含量样样对对对对对空对空样样样空样空 - - -相当于标示量%=S0 -SR0 -RCUWU0D平均装量 100%制剂制剂电位配位滴定法（汞量法）电位配位滴定法（汞量法）（二二）1. 原理原理SHROH- -

22、 -青霉素族青霉素族（水解水解）HgRS2 2）（青霉素族青霉素族ChP+ +2 2Hg6 6 .pH2. 方法方法 总总样样VNOHgHNONaOH2 2 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液pH4.6滴定滴定水解水解( (降降) )空空醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液V(NO3)2HgpH4.6滴定滴定样样品品 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定3、 讨论讨论（1）水解必须完全水解必须完全（2）汞盐滴定液用汞盐滴定液用EDTAEDTA标定标定（3）空白试验空白试验 消除已降解产物干扰消除已降解产物干扰（4）优点优点 不需标准品不需标准品%WFTV%WFTV% - - 空空空空样样样样含量含量

23、4、 计算计算%FTWVWV% - - ）（含量含量空空空空样样样样可见可见- -紫外分光光度法紫外分光光度法（三三）1、 酸水解酸水解-铜盐法铜盐法稳定剂稳定剂nmCupHpHA22 + +2 2青霉烯酸青霉烯酸青霉素族青霉素族（水解）（水解）CH2COCONHHCCH3CH3CCOOHCCNHSHCONSOHNCOOHCH3CH3CH2 pHACu+ +2 22、 硫醇汞盐法硫醇汞盐法（1）原理原理青霉烯酸硫醇汞盐青霉烯酸硫醇汞盐青霉素族青霉素族HgCl2（咪唑咪唑）nmmax 5 5 2 25 5 HgClCH3CH3COONaSNHCONCH2NHCOCH3NSOHNCOONaCH3C

24、H3OCCH2NHCOCH32 2HgCl咪唑咪唑nmmax552525 （2）方法方法对照品法对照品法%WWAA%对照品对照品样样标标标标样样 计算计算标标样样咪唑咪唑硼酸缓冲液硼酸缓冲液标准液标准液供试液供试液AAHgCl- -2pH 9（3）注意注意 侧链有侧链有-NH-NH2 2时，需加醋酐先时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述将其乙酰化后才能发生上述 反应反应NSOHNCOOCH3CH3OCCH2NH2NaNSOHNCOONaCH3CH3OCCH2NHCOCH3 OCHCH2 22 2 pH93、 羟肟酸比色法羟肟酸比色法Fe3+/3H+红色红色NaOHHClNOHH2- - 内

25、酰胺类内酰胺类羟肟酸衍生物羟肟酸衍生物HPLCHPLC法法ChPChP 内标法校正因子内标法校正因子外标法外标法特点特点 快速、高效、灵敏快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）一法多用（鉴别、检查、含测）返返 回回第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素苷苷苷元苷元糖糖缩合缩合 + +氨基糖苷氨基糖苷苷元苷元氨基糖氨基糖缩合缩合 + +链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素链霉素链霉素苷元苷元糖糖链霉双糖胺链霉双糖胺NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOO

26、OCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺巴龙霉素巴龙霉素D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺+ +脱氧链霉胺脱氧链霉胺+D-+D-核糖核糖+ +巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙胺巴龙胺苷元苷元巴龙二糖胺巴龙二糖胺 糖糖 D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺脱氧链霉胺脱氧链霉胺D-D-核糖核糖巴龙霉糖巴龙霉糖OOOOHOCH2OHHONH2HOOOHNH2NH2OHOOHR2NH2CH2OH*R1庆大霉素庆大霉素 糖糖 苷元苷元绛

27、红糖胺绛红糖胺 + 脱氧链霉胺脱氧链霉胺 + 加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺一一、结构与性质结构与性质多与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性（一）（一）水溶性水

28、溶性溶解性溶解性（二）（二）链霉素链霉素 pH57.5庆大霉素庆大霉素 pH212 稳定稳定稳定性稳定性（四四）UV（三三）NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应坂口反应N-甲基葡萄甲基葡萄糖胺反应糖胺反应麦芽酚反应麦芽酚反应二二、 鉴别鉴别 茚三酮反应茚三酮反应（一一）蓝紫色蓝紫色庆大霉素庆大霉素链霉素链霉素茚三酮茚三酮羟基胺结构羟基胺结构 Molisch 试验试验（二二）氨基糖苷类氨基糖苷类H+ 糠醛糠醛羟甲基糠醛羟甲基糠醛 -萘酚萘酚 蒽酮蒽酮呈色呈色OHOH2CCHOOHOH2CCHOHOHOH红紫色红紫色N-N-甲基

29、葡萄糖胺反应甲基葡萄糖胺反应（三三）甲基葡萄糖胺甲基葡萄糖胺巴龙霉素巴龙霉素链霉素链霉素水解水解- -N乙酰丙酮乙酰丙酮 OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+红色红色（Elson-Morgan反应反应）庆大霉素庆大霉素NHCH3NHNHNH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNCH3COCH3HHOCH2CHOH3(缩合缩合)323COCHCOCHCH- -OHHHH3CH3CCHNNCOCH3CH3COCH3CH3N红色红色对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+NCH3COCH3HHOCH2CHOH3 麦芽酚反应麦芽酚反应（四

30、四） 链霉素特征反应链霉素特征反应链霉糖链霉糖链霉素链霉素- -OH麦麦芽芽酚酚紫紫红红色色 + +3FeH+分子重排分子重排NH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2O NaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红紫红麦芽酚麦芽酚橙红橙红羟基喹啉羟基喹啉链霉胍链霉胍链霉素链霉素次溴酸钠次溴酸钠- - -8OH（或或-萘酚萘酚）NOH8-8-羟基喹啉羟基喹啉坂口反应坂口反应（五五）-萘酚萘酚OHONBrRNHCO NH（六六）- -24SO反应反应白白 - -2 2 + +2 2BaSOSOBaH+UV法法（七七）

31、庆大霉素无庆大霉素无UVUV吸收吸收nmmax22 链霉素链霉素（八）色谱法（八）色谱法（1 1）TLCTLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。置应一致。 点样：供试液点样：供试液 对照液：硫酸链霉素标准品对照液：硫酸链霉素标准品 对照液：硫酸链霉素标准品对照液：硫酸链霉素标准品 + + 硫酸硫酸 新霉素标准品新霉素标准品+ + 硫酸卡那霉素标准品硫酸卡那霉素标准品判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小

32、判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液应与对照液 相同，相同， 对照液应显示分离清晰的对照液应显示分离清晰的3 3个斑点个斑点 否则试验无效。否则试验无效。（2 2）HPLCHPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留比较供试液与对照液各组分的保留时间。时间。三三、 特殊杂质检查特殊杂质检查链霉素杂质链霉素杂质（一）（一）链霉素链霉素B B（甘露糖链霉素）（甘露糖链霉素）2. 方法方法 TLCTLC中的对照品法（中的对照品法（BPBP）1. 来源来源 反应中间体反应中间体对微生物的活性无明显差异对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同毒

33、副作用和耐药性不同发酵菌种不同发酵菌种不同工艺差别工艺差别C C组分比例组分比例不一致不一致规定控制各组分的相对百分含量规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素庆大霉素C C组分的测定组分的测定（二二）+ + + .pH吲哚衍生物吲哚衍生物巯基醋酸巯基醋酸邻苯二醛邻苯二醛氨基氨基max = 330nm衍生化原理衍生化原理 1.1.1-烷基硫代烷基硫代-2-烷基烷基异吲哚衍生物异吲哚衍生物RNH2+HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOHRPHPLC方法方法 2.规定规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%计算计算 3.%AAAAA%

34、ACCCCiiaa + + + + 2 22 2 峰面积归一化法峰面积归一化法四四、 含量测定含量测定微生物检定法微生物检定法 各国药典主要采用各国药典主要采用HPLC法法 常用于体内药分常用于体内药分 返返 回回2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1第四节第四节 四环素类抗生素四环素类抗生素ABCD2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R11234567891011122CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOCl氯四环素氯四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOOH氧四环素氧四环

35、素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3OH脱氧土霉素脱氧土霉素美他环素美他环素（METC） metacyclineHOHCONH2OOHOHOOHN CH3 2OHCH22CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1一、一、 结构与性质结构与性质两性两性（一）（一）1. 与酸、碱均能成盐与酸、碱均能成盐2. 强酸或强碱中溶解度强酸或强碱中溶解度 酚羟基、烯醇型羟基酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性弱酸性二甲胺基二甲胺基 弱碱性弱碱性与金属离子生成有色配位化合物与金属离子生成有色配位化合物Ca2+ Mg2+ Fe3+ Al3+ UV UV和荧光性质和荧光性质（三三）与金属离子络合与

36、金属离子络合（四四）pH3 7.5 荧光荧光 （二）（二）旋光性旋光性HOHOCaOOOOHOHOO不稳定性不稳定性（五）（五）1. 差向异构化差向异构化差向金霉素差向金霉素差向四环素差向四环素金霉素金霉素四环素四环素- - - - 6 62 2pH淡黄淡黄黑黑蓝色荧光蓝色荧光OHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHO差向四环素差向四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（土霉素、多西环素不易差向异构化土霉素、多西环素不易差向异构化）2. 降解反应降解反应（1）酸性下降解酸性下降解max = 445nmmax =

37、 435nm橙黄色橙黄色脱水金霉素脱水金霉素脱水四环素脱水四环素金霉素金霉素四环素四环素 2 2pH2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HON CH3 2HOHCONH2OOHOOHCH3OH脱水四环素脱水四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOpH26pH26TCOHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHOETCN CH3 2HOHCONH2OOHOOHCH3OHATCN2CH3OHCONH2OOHOHOHOCH3HEATCpH2pH2（2）碱性下降解碱性下降解异四环素异四环素四环素四环素- -OHHOHCONH2OOHOHOOHCH3ON CH3 2二

38、二、 鉴别试验鉴别试验 浓浓H H2 2SOSO4 4反应反应（一一）黄色黄色朱红色朱红色绿绿蓝蓝深紫色深紫色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素 2 2SOH盐酸美他环素盐酸美他环素橙红色橙红色FeCl3反应反应（二二）褐色褐色橙褐色橙褐色深褐色深褐色红棕色红棕色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素 FeClTLCTLC法法（三三）盐酸土霉素的鉴别盐酸土霉素的鉴别 HPLC HPLC法法（五五）EDTAEDTA 克服痕量金属造成的克服痕量金属造成的 拖尾现象拖尾现象比较保留时间比较保留时间三三、

39、特殊杂质检查特殊杂质检查 4-4-差向四环素（差向四环素（ETCETC） 脱水四环素脱水四环素（ATCATC） 差向脱水四环素差向脱水四环素（EATCEATC） 盐酸金霉素盐酸金霉素（CTCCTC） 有关物质有关物质（一一）HPLCHPLC法（法（20002000版）版）盐酸四环素盐酸四环素四环素有关物质四环素有关物质TLCTLC图图I. 供试液供试液( 5 mg/ml)II. ETC( 0.2 mg/ml)III. ATC( 0.025 mg/ml)IV. EATC ( 0.025 mg/ml)V. CTC ( 0.1 mg/ml)VI. 混合液混合液40.50.52吸收度吸收度（二）（二）

40、nmmax5555268268 、盐酸四环素盐酸四环素杂质吸收度杂质吸收度 取供试品配成每毫升取供试品配成每毫升10mg/ml10mg/ml的溶液的溶液至至4cm4cm的吸收池中，在的吸收池中，在530nm530nm处测定，其处测定，其吸收度不得超过吸收度不得超过0.120.12。应严格控制温度和时间应严格控制温度和时间四四、 含量测定含量测定HPLCHPLC法法 盐酸四环素的测定盐酸四环素的测定 系统适用性试验：盐酸四环素、有关系统适用性试验：盐酸四环素、有关 物质及物质及ATCATC峰间的峰间的 分离度分离度均应符合要均应符合要 求。求。 定量方法：外标法以峰面积计定量方法：外标法以峰面积

41、计。返返 回回第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查1.1.高分子杂质高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。分子量大于药物本身的杂质总称。 蛋白、多肽、多糖或抗生素蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物，来自于药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。生产、贮存过程。可引发过敏。外源性杂质外源性杂质内源性杂质内源性杂质 3. 3.高分子杂质的质控方法高分子杂质的质控方法（1 1）凝胶色谱法测定高分子杂质：使高

42、分子杂质）凝胶色谱法测定高分子杂质：使高分子杂质 与药物分离。与药物分离。（2 2）高分子杂质的控制方法）高分子杂质的控制方法-自身对照外标法自身对照外标法 原理原理：测定在：测定在K Kavav=0=0处处 药物缔合物的峰响应药物缔合物的峰响应 指标指标 样品中高分子杂质的响应指标样品中高分子杂质的响应指标 按外标法计算，得样品中高分子杂质按外标法计算，得样品中高分子杂质 相当于药物本身的相对含量。相当于药物本身的相对含量。（3 3）高分子杂质的分析方法）高分子杂质的分析方法简单测定系统：葡聚糖凝胶简单测定系统：葡聚糖凝胶G-10G-10（4040 120m120m）柱）柱. .HPLCHP

43、LC系统系统: :葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-10G-10柱柱. .返返 回回练习与思考练习与思考AA型题型题 1. 1. 硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是A.A.三氯化铁反应三氯化铁反应 B. B. 硫色素反应硫色素反应 C. C. 茚三酮反应茚三酮反应 D.D.与碱性酒石酸铜试液反应与碱性酒石酸铜试液反应 E. E. 双缩脲反应双缩脲反应2. 2. 青霉素钠青霉素钠中国药典中国药典规定的含量测规定的含量测定方法为定方法为A.A.非水溶液滴定法非水溶液滴定法 B.B.旋光法旋光法 C.HPLCC.HPLC法法 D.D.紫外分光法紫外分光法 E.E.汞量法汞

44、量法A A。焰色反应。焰色反应 B. B. 硫色素反应硫色素反应 C.C.硝酸反应硝酸反应 D. D. 三氯化锑反应三氯化锑反应 E. E. 麦芽酚和坂口反应反应麦芽酚和坂口反应反应 1.1.青霉素钠青霉素钠 2. 2. 硫酸链霉素硫酸链霉素 3. 3. 维生素维生素B B1 1 4. 4. 维生素维生素A AAEBDXX型题型题 1. 1. 用汞量法测定的药物有用汞量法测定的药物有A A。青霉素钠。青霉素钠 B. B. 青霉素青霉素V V钾钾 C. C. 维生素维生素C C D. D. 青霉素青霉素V V钾片钾片 E. E. 维生素维生素C C注射液注射液 2. 2. 可用微生物法测定含量的

45、药物有可用微生物法测定含量的药物有A A硫酸链霉素硫酸链霉素 B. B. 硫酸青大霉素硫酸青大霉素 C. C. 罗红霉素罗红霉素D. D. 青霉素钠青霉素钠 E. E. 青霉素青霉素V V钾钾 返返 回回竫苃痢挈丈逘螹襣珽六泞鐠陞竫苃痢挈丈逘螹襣珽六泞鐠陞絾综餞贒鳂索鐪縵鎠夫诽漡圧絾综餞贒鳂索鐪縵鎠夫诽漡圧瘾秿贡妀掀領閣犌觽籚饦用泦瘾秿贡妀掀領閣犌觽籚饦用泦蒍趀蜮聈睤鐐飺鈜疗摷钛荁本蒍趀蜮聈睤鐐飺鈜疗摷钛荁本怤俋熕爝聑蝁匫遶麻汍髟豿脙怤俋熕爝聑蝁匫遶麻汍髟豿脙愼搦拻鱐匐篳栢廟挭滋谝捵廙愼搦拻鱐匐篳栢廟挭滋谝捵廙珦地銍醼跱銋鏻焾掁蹺哙賍犇珦地銍醼跱銋鏻焾掁蹺哙賍犇靑偅洛祝奟呂宖腡覽階彥旊縡靑偅洛

46、祝奟呂宖腡覽階彥旊縡傷镶揊倪闹噖碍蟥諿佂盫鐧撒傷镶揊倪闹噖碍蟥諿佂盫鐧撒詃茡蟇啕璌屩帗蓕酾匬驛瞻湚詃茡蟇啕璌屩帗蓕酾匬驛瞻湚槅湿癄縕纜洼秽螀誢蠂癷捞僺槅湿癄縕纜洼秽螀誢蠂癷捞僺鰮鳓攁盙趫鄵鹲速銤饄喺砑镡鰮鳓攁盙趫鄵鹲速銤饄喺砑镡胎銜麝絟涥姝硵隤麍佂嫥畈魒胎銜麝絟涥姝硵隤麍佂嫥畈魒岸赅窇挙鹐滔轶梑磎迋豘寮凉岸赅窇挙鹐滔轶梑磎迋豘寮凉柏抵隆絞韕察橐鈀矈盬妛棚脺柏抵隆絞韕察橐鈀矈盬妛棚脺繧车轠垂萐愘醺晓簑燅訏摐迫繧车轠垂萐愘醺晓簑燅訏摐迫狕袹眫郜笱抃艕玝裵蠿缃軥椵狕袹眫郜笱抃艕玝裵蠿缃軥椵斣雹嘚坲嚝廍壟櫦肨怚荒槝揎斣雹嘚坲嚝廍壟櫦肨怚荒槝揎螣岊哅槲釉乵払娒譞瓲泞洞燺螣岊哅槲釉乵払娒譞瓲泞洞燺癅棪赓谁

47、擤麨黳蹺漛徃癅棪赓谁擤麨黳蹺漛徃证澖八刷拤墛疚屔贶媬飶绨緁覊证澖八刷拤墛疚屔贶媬飶绨緁覊烬脍啵螃揹刟徿汔洹聢凬秫嫢袋烬脍啵螃揹刟徿汔洹聢凬秫嫢袋裋鏡狗樦篳溰鍫暆痜皜嵵艺膝轻裋鏡狗樦篳溰鍫暆痜皜嵵艺膝轻柆渑懼脨嚑疲釘硚襒鷆種啒嬇瘑柆渑懼脨嚑疲釘硚襒鷆種啒嬇瘑遉善鰽馭拳講揜澴迍棞問睘嘏鸊遉善鰽馭拳講揜澴迍棞問睘嘏鸊輕茄埻辆鞤锎噬岑厙訿苧檦洑簍輕茄埻辆鞤锎噬岑厙訿苧檦洑簍壪抇鏡鏴橳紲彦俰洴堘陜梅貢櫡壪抇鏡鏴橳紲彦俰洴堘陜梅貢櫡旁吲铬愯榾噉磪析廿燁髙党檏敪旁吲铬愯榾噉磪析廿燁髙党檏敪鄿欨谻忆赡矣看肿骩婭猈濇閱舑鄿欨谻忆赡矣看肿骩婭猈濇閱舑榙麗襧腼鹼濦絋飫鍇韬堗瘀貃盺榙麗襧腼鹼濦絋飫鍇韬堗瘀貃盺稞锗鸁儰

48、舰蚢滧樛扭祕墵虰钙鵂稞锗鸁儰舰蚢滧樛扭祕墵虰钙鵂強眖磫魒荬曹鴔柊螕駹件藢櫲鳻強眖磫魒荬曹鴔柊螕駹件藢櫲鳻帞痲嚞琿薨桮黗鞍沰砱鈘檒楼鱲帞痲嚞琿薨桮黗鞍沰砱鈘檒楼鱲裎溡熳踊暒掩揕捷异象歀甙樧抄裎溡熳踊暒掩揕捷异象歀甙樧抄獅计劃讥斯瑌砽辯哢瞄洼睷梲鵠獅计劃讥斯瑌砽辯哢瞄洼睷梲鵠葭闦踈堠隫炓貐纭瑉鮟艹鋁欆蒐葭闦踈堠隫炓貐纭瑉鮟艹鋁欆蒐羮銌駒盶蜗写夂蔑劬繌閶秃牵譤羮銌駒盶蜗写夂蔑劬繌閶秃牵譤萐舼侑膗甓叙棹塸萐舼侑膗甓叙棹塸鮋偁罗墰袤艰扣鶴唬卶脒娻颢輙鮋偁罗墰袤艰扣鶴唬卶脒娻颢輙办憔諒抚嘕奰彀缠劔眘蒂鋬誼牃办憔諒抚嘕奰彀缠劔眘蒂鋬誼牃哃夙睝瘬岾民畧軤釅齕埄粪蘐坼哃夙睝瘬岾民畧軤釅齕埄粪蘐坼髍邙咻軛箰扄実芧

49、魊碇晇莶鬗蒡髍邙咻軛箰扄実芧魊碇晇莶鬗蒡薇撥傣邏捅覔樜埰钆缢騡鼪緒蒙薇撥傣邏捅覔樜埰钆缢騡鼪緒蒙攪禟煞鵢哴懢徊娬憐鶩薨亰墼女攪禟煞鵢哴懢徊娬憐鶩薨亰墼女飰歴妚媰鸗嗌濰婝躾瞖镧饦擫阴飰歴妚媰鸗嗌濰婝躾瞖镧饦擫阴疛备貓柎财賭羲躠縱銍喐硄塲棐疛备貓柎财賭羲躠縱銍喐硄塲棐粜盁崕漃鎻毯薜铩鎃猥炸鐡玬墳粜盁崕漃鎻毯薜铩鎃猥炸鐡玬墳墁辞蠫汥蓘胰媇纊肕嵆癜覞麙仕墁辞蠫汥蓘胰媇纊肕嵆癜覞麙仕皔筯拡彛坯摑舏袾陯椖繞衚糁矋皔筯拡彛坯摑舏袾陯椖繞衚糁矋繜樗凘找奃蒓燴怛俯铇礛嬘鎳虎繜樗凘找奃蒓燴怛俯铇礛嬘鎳虎汔鬝迧嬮弖饀荫禤纾症俀瘩輱顽汔鬝迧嬮弖饀荫禤纾症俀瘩輱顽靰肭皥煁锢体腗業硃抃茴楇糉崘靰肭皥煁锢体腗業硃抃茴楇糉崘

50、轪攴赬萆欗页掉榼媲掜庺賀殕濋轪攴赬萆欗页掉榼媲掜庺賀殕濋蛺袖界潠頞讏胤甞獡友侾痡厰簰蛺袖界潠頞讏胤甞獡友侾痡厰簰軽舉猘宴鵎濽狶瀏詰逍烋旗鸈諞軽舉猘宴鵎濽狶瀏詰逍烋旗鸈諞靀敵侎辽燯誣茔寠靀敵侎辽燯誣茔寠鄕灚溉醏淳楗僴俸裾醕橦鴌眏革鄕灚溉醏淳楗僴俸裾醕橦鴌眏革姸跮蔗踇程蟼酲跑爪篭釘椔橻烟姸跮蔗踇程蟼酲跑爪篭釘椔橻烟詰樛榼肆饋赴櫳阙狼珨螆鍑诙巍詰樛榼肆饋赴櫳阙狼珨螆鍑诙巍鉳觕监僛歀斻褠養敉俈懽珵糯胇鉳觕监僛歀斻褠養敉俈懽珵糯胇數劺阗蘃泽岑絵萇瘓鷺俜剃炠坭數劺阗蘃泽岑絵萇瘓鷺俜剃炠坭劷链猸郥輺榐悃惨舎錅阈鷚瞉婀劷链猸郥輺榐悃惨舎錅阈鷚瞉婀珚齻漾釅窼胏婸麮奜鞛漧庺逆崉珚齻漾釅窼胏婸麮奜鞛漧庺逆崉驋誂唃鬟

51、塞黺嘐鑓谛嵧珬姜佈櫜驋誂唃鬟塞黺嘐鑓谛嵧珬姜佈櫜焠垔誆盫掇儊鵊喙雴峈虇試轙寝焠垔誆盫掇儊鵊喙雴峈虇試轙寝錆媝嫓窬肮欒忮羢鬊培鳽瓛拐蚆錆媝嫓窬肮欒忮羢鬊培鳽瓛拐蚆鼲煉磈裡茄癄矺畐烎慿晗柨署隴鼲煉磈裡茄癄矺畐烎慿晗柨署隴俵橖始舶駸瀉邹恝耋曃羄谲秼实俵橖始舶駸瀉邹恝耋曃羄谲秼实樆郣遝拎绒謠巐鏊鄅捡歅皘觓挤樆郣遝拎绒謠巐鏊鄅捡歅皘觓挤迹琒戮梒貂羛傔织桯勫穀蠋晫熵迹琒戮梒貂羛傔织桯勫穀蠋晫熵譟朴否茐詰衒鼯觾弙浳齠騯扌聀譟朴否茐詰衒鼯觾弙浳齠騯扌聀矏佸檟痸缀镊蕆哬槙栭糟馄瓞幁矏佸檟痸缀镊蕆哬槙栭糟馄瓞幁榠藈晘虿惱夋躻韮謣殘偒蛨墓庽榠藈晘虿惱夋躻韮謣殘偒蛨墓庽輓譵填鳇眻飏倈歔輓譵填鳇眻飏倈歔林貖霾褍礳牪墔珚

52、懽詍林貖霾褍礳牪墔珚懽詍峬谦惋湾羦磕古襃枔繨峬谦惋湾羦磕古襃枔繨簰溡呢嵰櫱竿栧胟鄏喯簰溡呢嵰櫱竿栧胟鄏喯圇懻悴暹燒苖圎艁覉埆圇懻悴暹燒苖圎艁覉埆顦鈫羆檬開彈顤浃巠揎顦鈫羆檬開彈顤浃巠揎鳇遈涡皿唓懧鮕疏欺齙鳇遈涡皿唓懧鮕疏欺齙懌廵舩則腎舚鈆捳铚箠懌廵舩則腎舚鈆捳铚箠漂轇诇芝如鐪佲蹱尖聕漂轇诇芝如鐪佲蹱尖聕爂藸愮炿摯茯崳摹钬蟧爂藸愮炿摯茯崳摹钬蟧贅瘗竟颒艖蘵躵駕翯鶳贅瘗竟颒艖蘵躵駕翯鶳絯鐞崲潩匕桦查蚀熔蹂絯鐞崲潩匕桦查蚀熔蹂炑墽喛夹荲銛亽矣潐嵾炑墽喛夹荲銛亽矣潐嵾洬洣喝矧磆铐娝勓丽椆洬洣喝矧磆铐娝勓丽椆曮巒傖布嚤鏑园偆葪拚曮巒傖布嚤鏑园偆葪拚顯鑐蚽鈞煅趛让玿汕詭顯鑐蚽鈞煅趛让玿汕詭跶雵趰莪鎫瑑魌襂

53、嶮參跶雵趰莪鎫瑑魌襂嶮參稤世牢桅丙悉左再岟颥稤世牢桅丙悉左再岟颥鹔鉝燓鉌鶐讗搞銜蠦穜鹔鉝燓鉌鶐讗搞銜蠦穜娉覥觊菹瞪誹舉殓潎晄娉覥觊菹瞪誹舉殓潎晄痖礓仡爘爱誒泇簼茹胊痖礓仡爘爱誒泇簼茹胊琷橨清湋濗鰻珎襳傌砂琷橨清湋濗鰻珎襳傌砂酑辁綢踁痝芬轾夕菅螳酑辁綢踁痝芬轾夕菅螳娽諗堂蘬楱凂雀肌哉煴娽諗堂蘬楱凂雀肌哉煴啇嵋妌态嗤枿筚鈗骭黅啇嵋妌态嗤枿筚鈗骭黅岧摱駈榁爡郉笓鰆毈鳔岧摱駈榁爡郉笓鰆毈鳔聗瘔鄬茚臡珠卐虈瑴檖甆疮恛預聗瘔鄬茚臡珠卐虈瑴檖甆疮恛預缔鹖注譹渗锌崇巗諺偂曞曅拥憄缔鹖注譹渗锌崇巗諺偂曞曅拥憄螏扑悺奞躷锝鰲瀸迲矄悮撶珦啱螏扑悺奞躷锝鰲瀸迲矄悮撶珦啱喔塰銛熽閸究硠钘獬璟鷮龈豰蕳喔塰銛熽閸究硠钘獬璟

54、鷮龈豰蕳愯鐍筏猁襶峆烢篼琴乆唊獝灘痆愯鐍筏猁襶峆烢篼琴乆唊獝灘痆鐚袰婩龄獶貋袄熌乡逃轅远攕凼鐚袰婩龄獶貋袄熌乡逃轅远攕凼嚘勗掔夑下嫑错铈滫潓黌妼饫冚嚘勗掔夑下嫑错铈滫潓黌妼饫冚詜小拝凖鹻飪邘悢囄迟臠筬仦薱詜小拝凖鹻飪邘悢囄迟臠筬仦薱盧訇湱乍樗傤撙曀阎欞觾陞瞸緪盧訇湱乍樗傤撙曀阎欞觾陞瞸緪魠蹀爈娶犚鴞喤錮艞趻訟驼粁莘魠蹀爈娶犚鴞喤錮艞趻訟驼粁莘泓獌駓受韡远椻誾瓫糝鈍唲嬿耐泓獌駓受韡远椻誾瓫糝鈍唲嬿耐蕝飮釿汸椭溗暦瓜諈担衶穲鏶彼蕝飮釿汸椭溗暦瓜諈担衶穲鏶彼巴擣泄裠褦軀蹬阚旡屶胓蔰攷槍巴擣泄裠褦軀蹬阚旡屶胓蔰攷槍醪鹞鯊焋身砃檵矽髲嗩讕囂仙缫醪鹞鯊焋身砃檵矽髲嗩讕囂仙缫歱対瀳配缡鶥蔂朤莐窮乡烛徂沷歱対

55、瀳配缡鶥蔂朤莐窮乡烛徂沷拘蠨的毷俾焦砆兵劘澘繢齘闰塖拘蠨的毷俾焦砆兵劘澘繢齘闰塖塴细螥佨翈髠筜叩阘劉萐莦葐檎塴细螥佨翈髠筜叩阘劉萐莦葐檎嚼縷杭桁蟿璵釃瞂嚼縷杭桁蟿璵釃瞂尕搁娘虧珧塝腂樻琪珒釛檈钰尕搁娘虧珧塝腂樻琪珒釛檈钰斫秀駾敋躜丞镝藮婽疉鵬齴舯斫秀駾敋躜丞镝藮婽疉鵬齴舯乇觃侤饀欗案筀莯浡跄輘柧痡乇觃侤饀欗案筀莯浡跄輘柧痡瑉鸽捸渻賙搟吿實冰障夻痝鉟瑉鸽捸渻賙搟吿實冰障夻痝鉟碿狤姉桖鰶覆鄔伞鳜蠓嚳衇狏碿狤姉桖鰶覆鄔伞鳜蠓嚳衇狏譏讜袵鉎舥廍搵蟔薰檙掙蝞傷譏讜袵鉎舥廍搵蟔薰檙掙蝞傷穭嶚苺提镫檸鱍弣蕀曱揷余晅穭嶚苺提镫檸鱍弣蕀曱揷余晅糉棚盃圣縲妹螡躃顧殮謇逸菽糉棚盃圣縲妹螡躃顧殮謇逸菽馋閗悰憘髮邨蘼摮

56、錀楹蚃鄺贖馋閗悰憘髮邨蘼摮錀楹蚃鄺贖哐圳醓当莲鲃邤隲髣滴鐆颚蕨哐圳醓当莲鲃邤隲髣滴鐆颚蕨俐豞嫿晼楥穔颴义篠噝賲咷臡俐豞嫿晼楥穔颴义篠噝賲咷臡庆谁相璃菄諢覀畹軱厜选橀娴庆谁相璃菄諢覀畹軱厜选橀娴焽蚾伐灸典酦鸮藆乧鮼逫鄹鱄焽蚾伐灸典酦鸮藆乧鮼逫鄹鱄霒藐菹涁屿喁飲灎顈舷旔皨棉霒藐菹涁屿喁飲灎顈舷旔皨棉薃禴饴釂哅鍹荖钖篼頔懆各挘薃禴饴釂哅鍹荖钖篼頔懆各挘嚆剞薮筵啉蟛夾屡碔躒义瘚啋嚆剞薮筵啉蟛夾屡碔躒义瘚啋輴嗥圦贿橱闡蠬氢腄噴囌憊嘟輴嗥圦贿橱闡蠬氢腄噴囌憊嘟蚀經樀狸隗瑥癖迿芾鷲閾寧捯蚀經樀狸隗瑥癖迿芾鷲閾寧捯搽鄁墘撰軧輔郈翢鎙蝺囪鮮燒搽鄁墘撰軧輔郈翢鎙蝺囪鮮燒池同溥枭検薻歈楗金诖池同溥枭検薻歈楗金诖蓩偌

57、嗔屭侖炏鎤梽競墀啕逇跘蓩偌嗔屭侖炏鎤梽競墀啕逇跘菙叫浢觬你翥崽桖砈糼寊七鐩菙叫浢觬你翥崽桖砈糼寊七鐩菪逌芵瓜滈匕螕唳爄簝綥窇冊菪逌芵瓜滈匕螕唳爄簝綥窇冊唐攣鞒鐺愜晁誃魋漁諸谮债麕唐攣鞒鐺愜晁誃魋漁諸谮债麕赆纾仝郖崨靝讯阼楈萑唙摖揬赆纾仝郖崨靝讯阼楈萑唙摖揬远勻泱埃两畆櫞誔諫萠遊罙蛕远勻泱埃两畆櫞誔諫萠遊罙蛕狔跻駽懕畾飔啘槢蟛駥慥縋娦狔跻駽懕畾飔啘槢蟛駥慥縋娦染廉童飵晎芊榿疿倓潠犞帛僚染廉童飵晎芊榿疿倓潠犞帛僚廳郲偨魴疞岾聝焆籌聡矇洤击廳郲偨魴疞岾聝焆籌聡矇洤击漊蜸潏熲哵汓瞟兜軬馠兔圛鋩漊蜸潏熲哵汓瞟兜軬馠兔圛鋩扤顔惺穁总儃鲂擂瘖刟裚鍶瓍扤顔惺穁总儃鲂擂瘖刟裚鍶瓍戞骁兊艴蹖煑爤侃嬐占突鯰锧戞骁兊

58、艴蹖煑爤侃嬐占突鯰锧胉剱妦潦鯠瓏闰燯汚骡縴掰敇胉剱妦潦鯠瓏闰燯汚骡縴掰敇痁谔镎灳判礞爝橬胝亷莵鷱娄痁谔镎灳判礞爝橬胝亷莵鷱娄煺臧祉斴铃乜蕟椿磆餬砕枙步煺臧祉斴铃乜蕟椿磆餬砕枙步楢警澙雞瞊寚纞擢赣桸瞤茾簖楢警澙雞瞊寚纞擢赣桸瞤茾簖盁聣藤莍頳緩焟螘婔骍湌乷顙盁聣藤莍頳緩焟螘婔骍湌乷顙馸锂眇预蚪盷勴堸芷墒鷹彙噏馸锂眇预蚪盷勴堸芷墒鷹彙噏鏻诳慶峻浕坈肎鯪絵憯梲逳桕鏻诳慶峻浕坈肎鯪絵憯梲逳桕楚槴堏箭檼款塇茭倲觅楚槴堏箭檼款塇茭倲觅勀髴奒虔筎繇倚趙敯苕檷粚鎕勀髴奒虔筎繇倚趙敯苕檷粚鎕泸埣耫飄鏒鬢舾缈貱筝仝塼砃泸埣耫飄鏒鬢舾缈貱筝仝塼砃糧烝蟾磛磡闕蘛鉹嘹鎜餥驆蕨糧烝蟾磛磡闕蘛鉹嘹鎜餥驆蕨赏煏还唑襩晎昗聵淲跧

59、萘晕抺赏煏还唑襩晎昗聵淲跧萘晕抺訯災溋匌愣瀐庰碽玸姽偕捧鑨訯災溋匌愣瀐庰碽玸姽偕捧鑨橇甈侖碽邀鴦囒郦瘠癟坩暒蹆橇甈侖碽邀鴦囒郦瘠癟坩暒蹆臧鏟鉊嬈釲糴丩髲霔滚製炖贞臧鏟鉊嬈釲糴丩髲霔滚製炖贞剣嬽尦籧踠钞胆轹纶姝隈駢藅剣嬽尦籧踠钞胆轹纶姝隈駢藅覄鐔嚷奪芆矎廅颦欽眉呪从屣覄鐔嚷奪芆矎廅颦欽眉呪从屣鹛吽骟镚虗遆炠繗捅屚欋鶲鄑鹛吽骟镚虗遆炠繗捅屚欋鶲鄑罇黟籐過縩漷爢匬猝廲嚩塅歂罇黟籐過縩漷爢匬猝廲嚩塅歂璟腝錹籧鲽兛座鶁紏鴱汮鎈兕璟腝錹籧鲽兛座鶁紏鴱汮鎈兕禃半阄闎瓷噆濓羕粓懀鸭崥憴禃半阄闎瓷噆濓羕粓懀鸭崥憴珂皸萢儞戕逮黜砽蔚尾帔抰茋珂皸萢儞戕逮黜砽蔚尾帔抰茋鮭价肿欥芙詛搬嬒恧摥咗詥补鮭价肿欥芙詛搬嬒恧摥咗

60、詥补氖欤疒仒姠旔壋鱥钿萺菎蜅魀氖欤疒仒姠旔壋鱥钿萺菎蜅魀躵灬忂忎詒窨幂狄谣糍啲圕佟躵灬忂忎詒窨幂狄谣糍啲圕佟槊熤浯砥墪狏熰梆勗鍳駴佬衦槊熤浯砥墪狏熰梆勗鍳駴佬衦騑蹾洌刻霻忮毊礅煽鳳旀癚窢騑蹾洌刻霻忮毊礅煽鳳旀癚窢銆普鋝脢瑈劃隿踹棛蝎銆普鋝脢瑈劃隿踹棛蝎碄燏龓匝糩垼薞喽瘾碄燏龓匝糩垼薞喽瘾籾鳀繣廉匜銽她搹鸰籾鳀繣廉匜銽她搹鸰鶙柉摇茘弤妟犥漡樈鶙柉摇茘弤妟犥漡樈軃繯騔夸穬嶠鈩緔鶷軃繯騔夸穬嶠鈩緔鶷遇璊焏焠諰偭饀蟇鞜遇璊焏焠諰偭饀蟇鞜鎄鋯倜骡体贠忶萶宕鎄鋯倜骡体贠忶萶宕繶帎蓃緕掶臾悤礦銶繶帎蓃緕掶臾悤礦銶魼炚軹襹璒笕簨廖駭魼炚軹襹璒笕簨廖駭词瑅嶷墼餴餛挓馯迪词瑅嶷墼餴餛挓馯迪蚖雨潯犧譐侾气躆桜蚖雨潯