2013核酸的提取及相关

1、核酸的提取及相关技术核酸的提取及相关技术I.I.质粒质粒DNADNA的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化II.II. 基因组基因组DNADNA的提取的提取III.III.总总RNARNA的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化IV.IV. mRNAmRNA的分离和纯化的分离和纯化V.V.核酸电泳技术核酸电泳技术VI.VI. 限制性内切酶限制性内切酶I. I. 质粒质粒DNADNA的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化一、质粒的基本性质一、质粒的基本性质 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不不等，为双链、共价闭合环状等，为双链、共价闭合环状D

2、NA分子分子（covalently closed circular DNA, 简称简称cccDNA） ，并以，并以超螺旋状态超螺旋状态存在于宿主细存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。对抗生素的抗性等。 质粒在细胞内的复制一般有二种：质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制紧密控制型（

3、型（stringent control）和和松弛控制型松弛控制型（relaxed control）。）。 前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上。在个以上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至多个扩增至1000-3000个。个。 质粒的不相容性（质粒的

4、不相容性（incompatibility） 利用利用同一复制系统同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为这种现象称为质粒的不相容性（质粒的不相容性（incompatibility）。）。但利用不同复制系统的不

5、同质粒可在同一宿主细胞但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在中共同存在。二、质粒二、质粒DNADNA的制备基本原理的制备基本原理( (碱法）碱法） 从细胞中分离质粒从细胞中分离质粒DNA DNA 的方法都包括的方法都包括3 3个基本步骤：个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒粒DNA.DNA.采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，SDSSDS和和Triton X-Triton X-100100可使细胞膜裂解。可使细胞膜裂解。处理后细菌染色体处理后细菌染色体DNADNA会缠绕附着在细胞碎

6、片上，同会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体时由于细菌染色体DNADNA比质粒大得多，易受机械力和核比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线形染色体当用强热或酸、碱处理时，细菌的线形染色体DNADNA变变性，而性，而cccDNAcccDNA的二条链不会相互分开。的二条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体当外界条件恢复正常时，线状染色体DNADNA片段难以复片段难以复性，而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒性，而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNADNA双

7、链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。以溶解状态存在于液相中。通过离心可获得通过离心可获得质粒质粒DNADNA。三、试剂三、试剂1) LB液体培养基液体培养基: 蛋白胨（蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 用用NaOH调至调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌。高压下蒸汽灭菌20分钟。分钟。2) LB固体培养基固体培养基：每升液体培养基加：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分分钟。钟。3) 氨苄青霉素（氨苄

8、青霉素（Amp）母液）母液：配成：配成50mg/ml水溶液，水溶液，-20 下保存备用。下保存备用。4) 溶液溶液I：50mmol/L葡萄糖、葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌15分钟分钟, 储存于储存于4 oC冰箱。冰箱。5) 溶液溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用临用前用10 mol/L NaOH母液稀释母液稀释)， 1%SDS.6) 溶液溶液III: 5 mol/L KAC 60ml, 冰醋酸冰醋酸 11.5ml, 水水28.5ml. 7) RNase A母液母液：将：将RNase

9、A酶粉溶于酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl, 终浓度为终浓度为10mg/ml。100 加热加热15分钟，冷却后分装。分钟，冷却后分装。8) 饱和酚：饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使缓冲液反复抽提，使pH达到达到7.6以上。以上。9) 氯仿：氯仿：按氯仿按氯仿/异戊醇异戊醇=24：1混合。混合。10)酚酚/氯仿：氯仿：将上述饱和酚和氯仿按将上述饱和酚和氯仿按1

10、：1混合。混合。11)TE缓冲液：缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸高压蒸气灭菌气灭菌15分钟分钟, 储存于储存于4 冰箱。冰箱。四、操四、操 作作 步步 骤骤1 1细菌的培养和收集：细菌的培养和收集：将含有质粒将含有质粒pBSpBS的的DH5DH5 菌株接种在菌株接种在LBLB固体培养基（含固体培养基（含5050 g/ml Ampg/ml Amp）中，）中，3737培养培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB5ml LB液体培养基（含液体培养基（含 5050 g/ml Am

11、pg/ml Amp）中，）中，3737培养约培养约1212小时至对数生小时至对数生长后期。长后期。2 2 质粒质粒DNADNA的少量快速提取的少量快速提取-碱裂解法碱裂解法 1).1). 取取1.5ml1.5ml培养液倒入培养液倒入1.5ml ependorf1.5ml ependorf 管中，管中，4 4下下12000g12000g离心离心3030秒。秒。 2).2). 弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。 3).3). 菌体沉淀重悬浮于菌体沉淀重悬浮于100100 l l 溶液溶液I I中（中（激烈震荡激烈震荡，充分混匀），室，充分混

12、匀），室 温下放置温下放置5-105-10分钟。分钟。 4).4). 加入新配制的溶液加入新配制的溶液II 200II 200 l l， 盖紧管口，并倒置离心管，温和颠盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒倒ependorfependorf管数次，以混匀内容物（管数次，以混匀内容物（千万不要震荡千万不要震荡）中，冰浴中）中，冰浴中 放置放置5 5分钟。分钟。 5).5). 加入加入150150 l l预冷的溶液预冷的溶液IIIIII， 盖紧管口，并倒置离心管，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒温和颠倒 ependorfependorf管数次，以混匀内容物，冰浴中放置管数次，以混匀内容物，冰浴中放置5

13、-105-10分钟。分钟。4 4下下 12000g12000g离心离心5-105-10分钟分钟, , 取取上清上清。6). 将上清液移入干净将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的管中，加入等体积的酚酚/氯仿氯仿(1:1)，震荡混匀，震荡混匀，4下下12000g离心离心5分分钟。钟。7). 将上清液移入干净将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积管中，加入等体积的氯仿，震荡混匀，的氯仿，震荡混匀，4下下12000g离心离心5分钟。分钟。8). 将水相移入干净将水相移入干净ependorf管中，加入管中，加入2倍体积的倍体积的无水乙醇无水乙醇，震荡混匀后置于，震荡混匀后置于-2

14、0冰箱中冰箱中20分钟。分钟。然后在然后在 4下下12000g离心离心10分钟。分钟。9). 弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。加入液体流尽。加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀。乙醇洗涤沉淀。4下下12000g离心离心5-10分钟。分钟。10). 吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥尽，室温干燥或真空干燥10分钟分钟.11). 将沉淀溶于将沉淀溶于20 l TE缓冲液（缓冲液（pH8.0, 含含20 g/ml RNase A）中，储于）中，储于-20 C冰箱冰箱. 附附: 日常

15、型质粒日常型质粒DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒（硅膜吸附）硅膜吸附）原理：原理：带负电荷的带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。阳离子高的亲和力。阳离子Na发挥桥梁作用，吸附核酸发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，Na+ 打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，间的氢键，DNA与二氧化硅紧密结合，先洗涤除与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的去其他杂质，再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏缓冲液或蒸馏水洗脱结

16、合的水洗脱结合的DNA分子。分子。该试剂盒沿用传统的该试剂盒沿用传统的SDS碱裂解法，结合碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快的方法达到快速纯化质粒速纯化质粒DNA的目的。适合于从的目的。适合于从4ml LB细细菌培养物中提取菌培养物中提取520ug纯净的质粒纯净的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。消化、细菌转化等分子生物学实验。操作步骤操作步骤 第一次使用时，将试剂盒携带的第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAlRNaseAl全部全部加入到加入到S1S1溶液中，混合均

17、匀，溶液中，混合均匀，44保存。保存。1 1取取3ml3ml在在LBLB培养基中培养过夜的菌液培养基中培养过夜的菌液( (若使用丰若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少富培养基，菌液体积应减半或更少) )，12000rpm12000rpm离心离心20s20s，弃尽上清；，弃尽上清； 2 2用用0.25ml0.25ml已加入已加入RNaseAlRNaseAl的的S1S1溶液溶液悬浮细菌沉悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；3 3加加0.25ml 0.25ml S2S2溶液溶液，温和并充分地上下翻转混合，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成

18、透亮的溶液。此均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过步骤不宜超过5 min5 min；4 4加入加入0.5ml 40.5ml 4预冷的预冷的S3S3溶液溶液，温和并充分地上，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置静置2min2min。最高速度。最高速度(12000rpm)(12000rpm)离心离心5 min5 min；操作步骤操作步骤(续续)5吸取步骤吸取步骤4中的离心上清并转移到中的离心上清并转移到DNA制备管制备管(置于置于2ml离心管中离心管中)，3600rpm离心离心l min。如制备管中有液体残。如制备

19、管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心留，适当提高离心速度，再离心1 min，弃滤液；，弃滤液；6将将制备管制备管置回离心管，加置回离心管，加0.5ml Wl溶液溶液，3600rpm离心离心 30s，弃滤液；，弃滤液；7将制备管置回离心管，加将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液溶液，3600rpm离心离心30s；以同样的方法再用；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤溶液洗涤一次。弃滤液；液；8 将制备管移入离心管中，将制备管移入离心管中，12000rpm离心离心1 min；9 将制备管移入新的将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在离心管中，在DNA制备膜正中制备膜正中

20、央加央加60l水或洗脱液水或洗脱液，室温静置，室温静置lmin。 12000rpm离心离心l min洗脱洗脱DNA。质粒DNA电源图磁珠法提取磁珠法提取DNA原理原理 19941994年年T TL LHawkinsHawkins等发现羧基高分子表面在一定浓度等发现羧基高分子表面在一定浓度PEGPEGNaClNaCl条件下具有吸附核酸的能力，而在水或条件下具有吸附核酸的能力，而在水或TETE溶液中溶液中核酸又可以解吸附。核酸又可以解吸附。 因此，在磁珠表面连接可特异地与因此，在磁珠表面连接可特异地与DNADNA发生作用的功能基团，发生作用的功能基团，使其具有可逆吸附使其具有可逆吸附DNADNA的

21、特性。通常采用带有氨基、巯基、的特性。通常采用带有氨基、巯基、环氧基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化环氧基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表学修饰。高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附，而蛋白、单糖、多糖和脂类等细面可发生非特异性吸附，而蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理，这样就建立了一种以磁性微珠为胞成分不被吸附的原理，这样就建立了一种以磁性微珠为载体的载体的DNADNA纯化方法。纯化方法。 相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺寸小、偶相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺

22、寸小、偶联容量大、悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反联容量大、悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反应高效快速进行。应高效快速进行。 该核酸提取法对该核酸提取法对DNA结构没有损伤，结构没有损伤，生物相容性高，生物相容性高，DNA可直接洗脱应用，可直接洗脱应用，纯度及纯化效率等方面都较高。纯度及纯化效率等方面都较高。II、基因组、基因组DNA的提取的提取一、概述一、概述 染色体染色体DNA 通常用于构建基因组文库和通常用于构建基因组文库和Southern杂交等，杂交等，同时在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的同时在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。研究

23、目标。1、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色体染色体DNA的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的段的4倍）。当用倍）。当用Cosmid构建文库时，片段长度应大于构建文库时，片段长度应大于200kb;用噬菌体构建文库时应大于用噬菌体构建文库时应大于80kb。但在制备过程中，有机溶。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成DNA断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段。断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段

24、。2、Southern杂交：用于杂交：用于Southern杂交的染色体杂交的染色体DNA片段长片段长度要求可适当降低。度要求可适当降低。3、PCR AFLPRFLP等：等：DNA片段长度要求可适当降低。片段长度要求可适当降低。一、概述一、概述 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；同种生物的不同种类的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的织的DNA时，必须参照文献

25、和经验建立的相应提时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的取方法，以获得可用的DNA大分子。大分子。 不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体取缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体DNA提取所用的提取缓冲液为：提取所用的提取缓冲液为：18.6g葡萄糖、葡萄糖、6.9g二乙基二硫代碳酸钠（二乙基二硫代碳酸钠（Sarkosyl）、）、6.0gPVP、240ul巯基乙醇、加水至巯基乙醇、加水至300ml二、植物基因组二、植物基因组DNA提取提取(水稻和其它禾本科植物)1、试剂试剂 A. 提取缓冲液 ：

26、100mmol/L TrisCl（pH8.0）、 20mmol/L EDTA、500mmol/L NaCl、1.5% SDS。 B. 氯仿/戊醇/乙醇溶液: 80: 4: 16 / 氯仿: 戊醇: 乙醇 C. 异丙醇 D. TE: 10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 冰箱。 E. RNase A：10mg/ml F. 3mol/L NaAC2、实验步骤、实验步骤A. 在在50ml离心管中加入离心管中加入20ml提取缓冲液提取缓冲液，60水浴预热。水浴预热。B. 水稻幼苗或叶子水稻幼苗或叶子5-10g ，剪碎

27、，在研钵中加，剪碎，在研钵中加液氮磨液氮磨成粉状后成粉状后立即倒入预热的含立即倒入预热的含提取缓冲液提取缓冲液的离心管中，剧烈摇动混匀，的离心管中，剧烈摇动混匀，60水浴保温水浴保温30-60分钟（时间长，分钟（时间长，DNA产量高），不时摇产量高），不时摇动。动。C. 加入加入20ml 氯仿氯仿/戊醇戊醇/乙醇溶液乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置止损伤皮肤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。层（必要时可重新混匀）。D. 室温下室温下5000rpm 离心离心5分钟。分钟。E. 仔细移取上清液至

28、另一仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积离心管，加入一倍体积异丙醇异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。沉淀。F.F.用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。干。转入含转入含1ml TE 的的1.5ml eppendorf管中，管中，DNA很快溶解很快溶解于于TE。G.如如DNA不形成絮状沉淀，则可用不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心离心5分钟，再将分钟，再将沉淀移入沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可，可在

29、在60水浴放置水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。分钟以上，以帮助溶解。2 2、实验步骤、实验步骤( (续）续）H. 将将DNADNA溶液溶液3000rpm离心离心5 5分钟，上清液倒入干净的分钟，上清液倒入干净的5ml5ml离心管。离心管。I. I. 加入加入5ulRNase A（10ug/ul10ug/ul），），3710分钟，除去分钟，除去RNARNA（RNARNA对对DNADNA的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。J. J. 加入加入1/101/10体积的体积的3mol/L 3mol/L NaACNaAC及及2x2x体积的冰乙醇体积的冰乙醇，混匀，

30、混匀，-20-20放置放置2020分钟左右，使分钟左右，使DNADNA形成絮状沉淀。形成絮状沉淀。K. K. 用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。吸干。L. L. 将将DNADNA重新溶解于重新溶解于1mlTE中，中，-20贮存。贮存。M. M. 取取2ul DNA样品在样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测胶上电泳，检测DNADNA的分的分子大小。同时可取子大小。同时可取15ul 稀释稀释2020倍，测定倍，测定OD260/OD280，检，检测测DNADNA含量及质量。含量及质量。 3、DNA纯度与浓度测定纯度

31、与浓度测定A、DNA纯度纯度：DNA的的OD260/OD280一般为一般为1.8左右。左右。 OD260/OD280 1.8：说明较纯；：说明较纯； OD260/OD280 1.8：说明可能有：说明可能有RNA污染；污染； OD260/OD280 1.8：说明可能有蛋白质污染。：说明可能有蛋白质污染。B、DNA浓度浓度：当：当OD260为为1时，时，dsDNA含量为含量为50ug/ml, ssDNA或或RNA含量为含量为40 g/ml；单链寡核；单链寡核苷酸为苷酸为20 ug/ml. dsDNA（g/ml） = 50 OD260 稀释倍数稀释倍数附附: 动动/植物基因组植物基因组DNA小量纯化

32、试剂盒小量纯化试剂盒1 1、基本原理：、基本原理： 该试剂盒采用公司自身研该试剂盒采用公司自身研制的相分离技术和制的相分离技术和DNADNA制备膜制备膜选择性吸附选择性吸附DNADNA 的原理从的原理从1-1-10mg10mg新鲜动物组织或新鲜动物组织或2-20mg2-20mg新新鲜植物组织中提取至多鲜植物组织中提取至多20ug20ug纯纯净的染色体净的染色体DNA.DNA. 2、实验步骤、实验步骤A. 样品收集：样品收集：100mg 新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨中，加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、

33、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充至粉末状。研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入分后将研钵放入65水浴至样品粉末刚开始融化。水浴至样品粉末刚开始融化。B.加入加入700ul G-A 溶液溶液和和1.2ul RNase A1贮存液贮存液，用力研磨，用力研磨30秒。秒。C.转移转移650ul研磨好的匀浆至研磨好的匀浆至2ml离心管中，如体积不到离心管中，如体积不到650ul, 加加buffer G-A 溶液至溶液至650ul, 65下保温下保温15min。D.加加400ul G-B溶液溶液和和1ml DV溶液溶液(4 预冷），用力混匀，预冷），用力混匀，

34、12000g离心离心2min.E.去上相液体，保留间相和下相溶液。加入去上相液体，保留间相和下相溶液。加入1ml DV溶液溶液(4 预冷），用力混匀，预冷），用力混匀， 12000g离心离心2min.F.去上相液体，将下相溶液转移至去上相液体，将下相溶液转移至微量滤器微量滤器(置于置于2ml离心管离心管中）。中）。12000g离心离心30秒。秒。2、实验步骤、实验步骤G.弃上相，在过滤液中加入弃上相，在过滤液中加入400ul DV溶液溶液,混合均匀。混合均匀。H.将将制备管制备管置于置于2ml 离心管中，加入步骤离心管中，加入步骤G的样品。的样品。12000g离心离心30秒。秒。I.弃滤液，将

35、制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml 离心管中离心管中, 加入加入500ul Wl 溶液溶液，12000g 离心离心30秒。秒。J.弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml 离心管中离心管中, 加入加入700ul W2 溶液溶液，12000g 离心离心30秒。秒。K.弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml 离心管中离心管中, 加入加入500ul W2溶液，溶液，12000g 离心离心1min。L.将制备管移入新的将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在离心管中，在DNA制备膜正中制备膜正中央加央加100-200l水水或或洗脱液洗脱液，室温静置，室温静置l min。最高

36、速度离。最高速度离心心l min洗脱洗脱DNA。三、细菌基因组三、细菌基因组DNA提取提取1、 试剂试剂A. 10%SDSB.蛋白酶K(20mg/ml)C.氯仿：异戊醇（24：1）; D. 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）E.70%乙醇F.TE, G. 5mol/L NaCl.H. RNase A：10mg/mlI.CTAB/NaCl 溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，缓慢加入10 g CTAB, 加水至100ml. (NaCl: Mr. 58; 0.8Mol/L)十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸

37、和酸性多聚糖的特性。在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。 在在高离子强度高离子强度的溶液里的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖(除酸性多聚糖) 形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌的某些株)中制备纯化DNA。 CTAB在制备基因组在制备基因组DNA的基本沉淀程序的基本沉淀程序：这种去污剂加入调节至高离子强度(0.7 mol/L NaCl)的细菌或细胞裂解液中。经过连续的酚和氯仿抽提去除CTAB黏多糖蛋白质复合物，用异丙醇无水乙醇沉淀上清即可获得基因组DNA。 CTAB结构式2、实验步骤：、实验步骤：A.

38、 5 ml细菌培养过夜，12000rpm离心3分钟，去上清液。B. 加567ul TE溶液悬浮沉淀，并加30ul 10% SDS, 3ul蛋白酶K(20mg/ml), 混匀，37水浴保温1小时。 C. 加100ul 的5mol/L NaCl,混匀。D. 加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65水浴保温10min.E. 用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心3分钟。F. 仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置10min, 即出现絮状DNA沉淀。G. 用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入100ul的

39、TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20。H. 取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。 同时取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。附注A. 如需降解RNA, 则在步骤G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37保温30分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。B. 用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心10分钟。C. 上清液至另一离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。D. 用玻棒捞出DN

40、A沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。E.将DNA重新溶解于1mlTE中，-20贮存。附附: 细菌基因组细菌基因组DNA小量制备试剂盒小量制备试剂盒实验步骤实验步骤：A.样品收集：1ml 细菌培养液5000rpm离心3分钟，用0.8ml细菌原生质体制备缓冲液悬浮沉淀，加20ul溶菌酶贮存溶菌酶贮存液液，冰上放置10min. 加0.3ml的0.25M EDTA, pH8.0, 混合均匀，冰上放置5min。 加0.3ml洗脱液，37保温5min.5000rpm离心5min.B.去上清，加0.1mlS-G溶液溶液，彻底悬浮沉淀，冰浴5min.C.加0.45ml50预热的G-A溶液溶液，用1m

41、l枪头快速吸注10次；若太粘稠，则在45下保温5min, 再用1ml枪头快速吸注10次。冰浴5min.D.加0.15mlG-C溶液溶液，混匀，12000rpm离心1min.E.将样品加于微量滤器微量滤器（置于2ml离心管中），12000rpm离心1min.实验步骤（续）实验步骤（续）F.吸取步骤E中的混合液，转移到DNA制备管制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1 min，弃滤液；G. 将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液溶液，3600rpm离心3 0s，弃滤液；H. 将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液溶液，36

42、00rpm离心30s；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤液；I.将制备管置于离心管中，12000rpm离心1min.J.将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在DNA制备制备膜膜正中央加60l水或洗脱液，室温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。细菌基因组DNA电源图真核细胞基因组真核细胞基因组DNA电源图电源图III、总、总RNA的制备的制备一、概述一、概述 中心法则中心法则: DNA mRNA 蛋白质蛋白质 真核生物真核生物mRNA的特点的特点: 真核生物的基因中有许多内真核生物的基因中有许多内含子含子, 需要通过需要通过RNA的拼接加工的拼接加工,才能成为成熟的

43、才能成为成熟的mRNA. 因此真核生物中提取的因此真核生物中提取的mRNA , 经反转录合成经反转录合成cDNA, 进而进而克隆基因已成为分子生物学最重要的方法之一克隆基因已成为分子生物学最重要的方法之一. 通常一个典型哺乳动物细胞约含通常一个典型哺乳动物细胞约含10-5ugRNA, 但其中但其中大部分为大部分为 rRNA（28S, 18S及及5S）和各种低分子量的）和各种低分子量的RNA(tRNA, 小核小核RNA等等), 只有只有1-5%为为mRNA。这些。这些mRNA的的大小和序列不一大小和序列不一, 但其但其3端有一个端有一个poly(A)的结构，的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽

44、。它编码了所有由该细胞合成的多肽。实验器皿处理实验器皿处理 mRNA的分子结构容易受到的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，酶的攻击反应而降解，加上加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是酶的污染并设法抑制其活性，这是实实验成败的关键。验成败的关键。 人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。套）。 所用的玻璃器皿需置于干

45、燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤烘烤2小时以上。小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的的焦碳焦碳酸二乙酯（酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。水溶液处理，再用蒸馏水冲净。 为了避免为了避免mRNA或或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。所有器皿一律需经硅烷化处理。RNA酶抑制剂酶抑制剂A. 焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）: 强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。但DEPC能与胺与巯基反应，因而含Tris溶液溶液和DTT的试剂的试剂不能用DEPC处理。

46、Tris溶液可用DEPC处理的水配制后、然后高压灭菌高压灭菌。 DEPC与氨与氨水溶液混合会产生致癌物！水溶液混合会产生致癌物！B. 异硫氰酸胍（异硫氰酸胍（Guanidinium isothiocyanate）: 为目前一种最有效的RNA酶抑制剂。它不但具有败坏细胞结构、核酸从核蛋白质中解离，同时也使RNA酶失活。因此在制备RNA时，缓冲液中常含有异硫氰酸胍。C. 其它：其它： 钒氧核苷酸复合物（Vanadyl-ribonucloside complex） RNA酶蛋白抑制制（RNasin） SDS, 尿素等二、试验方法二、试验方法 细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SD

47、S法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。 酚酚/SDS法制备总法制备总RNA1 基本原理基本原理： 第一步用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，第二步用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA和其它不纯物。2 2、试剂、试剂A. 匀浆缓冲液：0.18mol/L Tris, 0.09mol/L LiCl, 4.5mmol/L EDTA, 1% SDS, pH8.2）B. TLE： 0.2mol/L Tris, 0.1mol/L LiCl, 5mmol/L EDTA, pH8.2C. 经平衡的酚D. LiCl E. 3mol/L NaACF. 无水乙醇3 3、实验步骤

48、、实验步骤A.植物组织在液氮中磨成粉末，转入含植物组织在液氮中磨成粉末，转入含150ml匀浆匀浆缓冲液和缓冲液和50ml经经TLE平衡的酚的平衡的酚的500ml烧杯中烧杯中.B.匀浆匀浆2min，加，加50ml氯仿，温和混匀后，氯仿，温和混匀后，50放置放置20min。C.4下下10000rpm离心离心20分钟分钟. 水相部分加水相部分加50ml经经TLE平衡的酚平衡的酚, 混匀后加混匀后加50ml氯仿氯仿, 混匀混匀D.4下下10000rpm离心离心15分钟分钟, 水相部分用加经水相部分用加经TLE平衡的酚抽提直至无界面（一般平衡的酚抽提直至无界面（一般3次）。水相部次）。水相部分氯仿抽提一

49、次分氯仿抽提一次3 3、实验步骤、实验步骤( (续续) )E. 水相部分加水相部分加LiCl至至2mol/L, 4下沉淀过夜。下沉淀过夜。F.4下下10000rpm离心离心20分钟，用分钟，用2mol/L LiCl冲洗沉淀冲洗沉淀G. 用用5ml水溶解，加水溶解，加LiCl至至2mol/L，4下沉下沉淀淀2小时以上。小时以上。H. 4下下10000rpm离心离心20分钟，用分钟，用2mol/L LiCl冲洗沉淀冲洗沉淀I.用用2ml水溶解，加水溶解，加200ul 3mol/L NaAC和和5.5ml无水乙醇，无水乙醇，-20下沉淀过夜下沉淀过夜J.4下下10000rpm离心离心15分钟，用分钟

50、，用1ml水溶解。水溶解。异硫氰酸胍异硫氰酸胍/酚法制备总酚法制备总RNA1. 基本基本原理原理 异硫氰酸胍异硫氰酸胍(GIT)与与巯基乙醇共同作用抑制巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；的活性；GIT与与 十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl）作用使蛋白质）作用使蛋白质变性，从而释放变性，从而释放RNA；酸性条件下；酸性条件下DNA极少发生解离，同极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建，逆转录及构建cDNA文库。文库。 与

51、氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。2. 试剂试剂A. 异硫氰酸胍溶液：异硫氰酸胍溶液：4mol/L 异硫氰酸胍（异硫氰酸胍（GIT），），25mmol/L柠檬酸钠（柠檬酸钠（pH 7.0）,0.5% 十二烷基肌十二烷基肌氨酸钠氨酸钠 （Sarcosyl）, 0.1M -巯基乙醇巯基乙醇 （用时再（用时再加加 0.36mL/50 mL 体系）体系）.B. 2mol/L NaAc （pH4.0）:用醋酸配，加少量水调用醋酸配，加少量水调pH。C

52、. 水饱和酚水饱和酚 （pH3.5）D. 氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1）E. 异丙醇异丙醇 ( 20存放存放)F. DEPC-H2O （0.1%，V/V）3 3、实验步骤、实验步骤A.取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4-5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。B.置于冰上，顺序加入：50l 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水饱和酚， 170l氯仿氯仿/异戊醇异戊醇，混匀。置冰上15min。C.4,12 000g离心20-30min。D.转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20沉淀30min-1hr或-80沉淀10min

53、。4,12 000g离心20min回收RNA。3 3、实验步骤、实验步骤( (续续) )E.用70乙醇洗一次，4，12 000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150l 异硫氰酸胍溶液，65吹打RNA沉淀溶解。F.加等体积异丙醇-20沉淀30min-1hr或-80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。G.用70乙醇洗两次后，溶于适量的DEPC-H2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于-80冰箱中存放。H. 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。Trizol法制备总法制备总RNA 1. 试剂Trizol

54、试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。2、实验步骤、实验步骤A. 将组织在液氮中磨成粉末后，再以将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入组织加入1mL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用液，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的体积的10% 。B. 研磨液室温放置研磨液室温放置5min，然后以每，然后以每1mL Trizol液加入液加入0.2 mL的的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。秒。C. 1

55、2000g 离心离心10min，取上层水相于一新的离心管，按每，取上层水相于一新的离心管，按每mL Trizol液加液加0.5 mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g 离心离心10min。D. 弃去上清液，按每弃去上清液，按每mL Trizol液加入至少液加入至少1mL的比例加入的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，乙醇，涡旋混匀，4下下7500g离心离心5min。E. 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要，注意不要干燥过分，否则会降低干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将的溶解度。然后

56、将RNA溶于水溶于水中，必要时可中，必要时可55-60助溶助溶 10min。RNA可进行可进行mRNA分分离，或贮存于离，或贮存于70%乙醇中于乙醇中于-70保存。保存。 附附: 总总RNA纯化试剂盒纯化试剂盒1)样品收集：称取样品收集：称取200mg新鲜植物叶片新鲜植物叶片，水冲净后，水冲净后用纸巾拭干，剪成碎片，立即浸入用纸巾拭干，剪成碎片，立即浸入液氮液氮，待冷冻完，待冷冻完全后边加液氮边碾磨全后边加液氮边碾磨(防止样品融化防止样品融化)，直至组织被，直至组织被碾磨成粉末状。碾磨成粉末状。2）. 样品匀浆样品匀浆 ： A. 在粉末状植物组织中加入少量液氮，再加在粉末状植物组织中加入少量液

57、氮，再加500ul R-A溶液，溶液，迅速碾磨至迅速碾磨至R-A溶液融化。溶液融化。B. 将组织匀浆转入将组织匀浆转入1.5ml离心管，如有较多组织匀浆离心管，如有较多组织匀浆残留在研钵中，加少量残留在研钵中，加少量R-A溶液，适当匀浆后收集溶液，适当匀浆后收集合并到合并到1.5ml离心管离心管. 冰浴冰浴5min。4 ， 在在12000rpm下离心下离心5min.C. 吸取吸取400ul上清转入另一上清转入另一1.5ml离心管中，测量匀浆离心管中，测量匀浆体积体积 (体积不足体积不足400ul时要加时要加R-A溶液补足溶液补足). 实验步骤（续）实验步骤（续）3)加加150ul R-E溶液溶

58、液，盖紧样品管，立即用力上下摇晃混合均，盖紧样品管，立即用力上下摇晃混合均匀。匀。4). 加加450u1的的 4预冷的预冷的R-C溶液溶液，盖紧样品管，立即用力上下，盖紧样品管，立即用力上下摇晃混合均匀，冰浴摇晃混合均匀，冰浴5min；4 下，下，12000rpm离心离心5min。 注意注意: RNA和少量游离基因组和少量游离基因组DNA位于下相位于下相，蛋白质与，蛋白质与基因组基因组DNA复合物形成相间沉淀，残留的碎片沉淀于离心复合物形成相间沉淀，残留的碎片沉淀于离心管底，脂质位于蓝色上相。管底，脂质位于蓝色上相。5) 弃蓝色上相，取弃蓝色上相，取800ul下相转移至另一离心管中下相转移至另

59、一离心管中(注意注意: 勿吸勿吸取界面和管底沉淀取界面和管底沉淀)。加。加560ul 的的R-D溶液溶液，盖紧样品管，用，盖紧样品管，用力上下摇晃混合均匀，冰浴力上下摇晃混合均匀，冰浴5min。6). 4下，下，12000rpm离心离心10min将将RNA沉淀于管底；沉淀于管底； 注意注意: 游离的基因组游离的基因组DNA位于下相，残留的蛋白质变性位于下相，残留的蛋白质变性析出形成相间沉淀，析出形成相间沉淀，RNA沉淀于离心管底。沉淀于离心管底。7)倒置离心管倒置离心管, 丢弃液相及界面沉淀。简短离心，仔细吸走残丢弃液相及界面沉淀。简短离心，仔细吸走残余液体。余液体。实验步骤（续）实验步骤（续

60、） 经此步骤纯化的总经此步骤纯化的总RNA纯度已满足诸如纯度已满足诸如Northern B1ot、RNA保护测定、体外翻译等多种保护测定、体外翻译等多种RNA分析，而无需作进分析，而无需作进一步纯化一步纯化(接步骤接步骤10）。仅当从富含）。仅当从富含RNA酶的细胞或组织酶的细胞或组织中提取总中提取总RNA，或纯化用于，或纯化用于RT-PCR分析的分析的RNA样品，或样品，或怀疑怀疑RNA样品中仍含有少量基因组样品中仍含有少量基因组DNA污染时，才进行污染时，才进行进一步纯化（接步骤进一步纯化（接步骤8）。）。 8). 加加100ul buffer R-A溶液和溶液和100ul RNAse-f