医学分子生物学-DNA的生物合成-coco

1、u DNA序列是序列是遗传信息的贮存遗传信息的贮存者，它通过自主者，它通过自主复制得到永存，复制得到永存，并通过转录生成并通过转录生成mRNA、翻译生、翻译生成蛋白质的过程成蛋白质的过程来控制生命现象来控制生命现象中心法则（the central dogma)：指生物体内遗传信息的传递方向第第13章章 DNA的生物合成的生物合成 (DNA Replication) 理解半保留机制和半不连续复制理解半保留机制和半不连续复制 掌握细菌掌握细菌DNA复制过程及酶的作用复制过程及酶的作用 掌握真核生物掌握真核生物DNA复制特点复制特点 掌握掌握DNA复制的类型复制的类型 掌握逆转录的特点掌握逆转录的特

2、点DNA合成复制（最主要的,DNADNA）逆转录（RNADNA）DNA的修复DNA重组技术聚合酶链反应（PCR）体内体外复制亲代DNA子代DNA复制(replication)亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，按照碱基配对原则合成子代DNA分子的过程。 DNA复制的体系 模板：DNA的两条单链 底物：dNTP 引物：提供3-OH的小片段RNA 酶：DNA聚合酶、引物酶、拓扑异构酶、解旋酶、SSB、DNA连接酶等。一. DNA复制的特点（一）半保留复制和半不连续复制（一）半保留复制和半不连续复制1. 半保留复制： DNA复制时，新合成的子代DNA与亲代完全相

3、同，且一条链来自亲代DNA，一条链是新合成的 。Meselson & Stahl, 1958同位素15N标记CsCl密度梯度离心实验。首先验明了DNA的半保留复制的假说。Meselson & Stahl, 1958解链方向2. 半不连续性复制3 5 3 5 353535 前导链 后随链冈崎片段前导链：DNA复制时，与复制叉移动方向一致，以35链为模板，按53方向连续合成的一条链5335后随链：DNA复制时，与复制叉移动方向相反，以53链为模板，按53方向不连续合成的一条链。DNA复制的体系 模板：DNA的两条单链 底物：dNTP 引物：提供3-OH的小片段RNA 酶：DNA聚合

4、酶、引物酶、拓扑异构酶、解旋酶、SSB、DNA连接酶等。（二）（二） DNA复制的相关蛋白复制的相关蛋白以单链DNA为模板，催化dNTP合成DNA，其活性需要Mg2+。活性：活性：l53 的聚合酶活性l核酸外切酶活性：3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性1. DNA聚合酶（聚合酶（DNA-pol） DNA聚合酶聚合酶 5 3 聚合酶活性聚合酶活性DNA聚合酶聚合酶 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶聚合酶 5 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A

5、G C G A C 5核酸外切酶活性的应用3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性?能切除引物和突变的 DNA片段。能辨认复制中错配的碱基对，并将其水解。(校对活性)Apol Ipol IIpol III亚基种类17105 聚合酶活性+ + 5 外切酶活性+5 外切酶活性+-持续合成能力32001500500000功能修复、切除引物修复复制原核生物的DNA聚合酶(1) DNA pol种类 核心酶： ， 全酶：是一个异二聚体复合物，其中一个单体合成前导链，另一个合成后随链；保证两条链以相同的速度进行合成DNA聚合酶IIIpol polpolpol pol 5 聚合酶活性+ + 5 外切酶活性-+5

6、 外切酶活性-引物酶活性+-功能合成引物修复线粒体DNA复制复制修复修复持续合成能力中等低高有PCNA时高高抑制剂蚜肠霉素双脱氧TTP双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素存在区域 细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核真核生物（哺乳动物）的DNA聚合酶2. 引引物物酶（酶（primase）作用：复制起始时催化生成短链RNA引物本质：是一种RNA聚合酶 如：Dna G蛋白（E.coli） DNA聚合酶（真核生物）解旋酶：二聚体或六聚体 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 例如：E.coli的Rep蛋白 3. DNA解链酶（解链酶（DNA helicase）拓扑异构酶 DNA复制时，负责调

7、整DNA超螺旋的圈数。拓扑异构酶拓扑异构酶(Top) 拓扑异构酶拓扑异构酶(Top ) ATP供能供能-+负螺旋负螺旋 消除和减少消除和减少 引入引入2个个切断方式切断方式双链中的一条双链中的一条双链双链定位定位转录区转录区染色质骨架蛋白和核基质染色质骨架蛋白和核基质相关功能相关功能转录转录复制复制 DNA拓扑异构酶& ：4. 拓扑异构酶（拓扑异构酶（DNA topoisomerase）生理功能： 维持单链状态，防止复性； 对抗核酸酶水解，保护单链完整。作用原理： SSB可结合32个核苷酸单位，可循环利用。5. 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSB)SSB蛋白能刺激同源的DNA聚合酶

8、活力p DNA连接酶（ligase）： 消耗能量（ATP或NAD+），催化相邻的DNA片段之间形成3,5-磷酸二酯键；6. DNA连接酶连接酶35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+ 大肠杆菌的DNA连接酶：不能连接两条游离的DNA单链。 T4 DNA 连接酶：可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。DNA复制的酶学小结E.coli复制起始点 oriC（长约245bp)三个三个13bp序列序列DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列1、复制起点ori p E.coli 的起点为ori C，约245

9、bp，含两组短的重复序列，富含AT和回文对称序列。（三） 复制起点与方向早期回文序列富含AT富含ATSV40起点酵母起始位点(自主复制序列ARS)真核生物的复制原点的研究是以酵母为基础的11bp的保守序列富含ATp 酵母的自主复制序列ARS：能指导DNA复制的起始)SV40起点17bp的富含AT区p 猴病毒SV40复制原点早期回文序列27bp的T-抗原结合位点：有回文序列复制原点的三个共同特征： l 含多个短重复顺序；l 这些短重复序列被多聚原点结合蛋白所识别；l oriC富含AT，使复制起点区易于解链以发动DNA复制。2、复制子及复制方向u 复制子（replicon)：基因组中能独立进行DN

10、A复制的单位。包含一个复制起点。u 复制方式：双向对称、双向不对称、单向复制；真核生物复制复制子真核：多个起点 多个复制子原核生物复制原核：一个起点 一个复制子E.coli 环复制真核生物的复制3、延伸方向：53DNA/RNA: 5 3蛋白质: NC4、部分生物DNA的复制速率复制速度：原核快、真核慢。二、原核生物DNA复制（一）原核生物DNA复制的过程1. DNA复制的起始2. DNA复制链的延伸3. DNA复制的终止以大肠杆菌DNA复制为例： DnaA 识别并结合复制起点，DnaBDnaC六聚体与oriC 形成预引发体； DnaG加入形成引发体，合成引物RNA； 有关酶和蛋白及DNApol

11、 组装到引发体上，组装形成复制体。1. DNA复制的起始引发复制复制起点DnaA单体结合在9bp重复处6个DnaC单体与1个DnaB六聚体结合形成DnaB/DnaC复合体DNA双链在13bp重复处分开20-40DnaA聚合呈大团复制体复制体引发体引发体2. 复制的延长 在DNA pol催化下，dNTP逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是3,5-磷酸二酯键的生成。大肠杆菌延长DNA的主要酶是DNA pol 冈崎片段合成开始冈崎片段合成终止聚合酶和滑动钳解聚滑动钳聚集后随链的合成 核心酶与滑动钳不断分离和聚合来合成冈崎片段.后随链的复制 DNA pol I (53外切酶活性)去除引物DNA

12、pol I (53聚合酶活性)填补空隙DNA 连接酶(NAD+)连接切口5353E E.coli 有两个ter终止区域，分别结合专一性的tus蛋白，共同阻止复制叉的进程。 序列一：terE terD terA 序列二：terB terC terF terG ter位点序列只引起一个方向的终止。 tus基因产物是一种DnaB解旋酶的抑制剂。3. 复制的终止细菌细菌DNA复制过程复制过程 （二）其他环状DNA分子的复制 起始方式： 从头起始（denovo initiation）: 复制、D环复制 共价延伸（covalent extesion） 滚环复制1. 复制中的大肠杆菌染色体在电镜下可看到形状

13、，因此也称复制。例如：绝大部分革兰氏阴性菌的质粒、多瘤病毒等环状DNA采用复制。2. 滚环复制 滚环复制：环状DNA分子的一条链上产生一个切口，切口的3-OH末端被DNA聚合酶延伸，新合成的链与模板链互补结合在一起而替换原来的亲代链。 例如：M13噬菌体、 X174、细菌F因子X174：单链环状DNA噬菌体，该单链为“+”链，在复制早期，以“+”链为模板合成”-“链，连接后形成双链闭合环状DNA(称为复制型，RF)RF型+链-链A蛋白切割复制原点3. D环复制 两条链的合成高度不对称,一条链迅速合成出互补链,另一条则形成游离的单链环(D-环)e.g.线粒体DNA H链上的原点( (细胞周期细胞

14、周期) )G1G1 preparing for DNA replication (cell growth)S SDNA replicationG2a short gap before mitosisMmitosis and cell division三、真核生物DNA的复制(DNA replication in Eukaryote) 1. 复制起始v 约20-50个复制子成簇在S期的特定时间同时开始复制。v S期的早期：常染色质的复制。v S期的晚期：异染色质的复制，被激活。v 中心粒的和端粒的DNA最后复制。2. 复制叉形成和延伸 DNA从核小体上解旋的速度为50bp/s，需要解旋酶和 RP

15、-A的存在。 由引物酶和行驶聚合酶功能的DNA pol起始两条链的合成，DNA pol进行DNA子链的延伸。端粒(telomere)：真核生物线性染色体末端的特殊结构，常膨大成颗粒状。3. 端粒与 端粒酶(telomere and telomerase) 功能 维持染色体结构的完整性； 维持DNA复制的完整性。（1）端粒结构特点 由端粒DNA序列和端粒结合蛋白构成。 端粒DNA是非编码的短串联重复序列，富含G/T例：四膜虫的端粒DNA 5-TTGGGGTTGGGG(TTGGGG)nTTGGGG-33-AACCCCAACCCC-5 是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程

16、对末端DNA链进行延长。 组成：端粒酶RNA端粒酶协同蛋白端粒酶逆转录酶（2） 端粒酶端粒的合成机制：不依赖模板，以爬行方式合成。母链通过非标准碱基配对回折DNA聚合酶复制子链端粒合成完成进一步加工 端粒及端粒酶的生理意义成年人端粒比胚胎细胞端粒短；老化与端粒酶活性下降有关；肿瘤的发生与端粒酶活性有关；原核与真核生物DNA复制的差异点一般性质比较原核生物真核生物复制起点单起点多起点复制子大而少小而多复制叉移动速度900bp/s50bp/s冈崎片段10002000bp100200bp引发策略引发酶产生引物，由pol延伸由pol 开始，由pol 完成复制多聚酶单体有不同进行性的异源二聚体每条链有不

17、同的酶，有不同的进行性拓扑学疏松和卷曲之间存在平衡，净为负超螺旋浓缩在核小体中的负超螺旋，高级结构影响拓扑学第二轮复制第一轮未结束就可以开始第二轮复制复制许可因子调控，复制周期不可重叠末端环状分子，末端不缩短线形分子，末端会缩短端粒酶-+原核与真核生物DNA复制的差异点复制体成分比较原核生物真核生物复制聚合酶pol pol /pol 进行性因子pol 的夹子PCNA引物酶DnaGpol 的引发酶解链酶DnaBT 抗原引物去除RNaseH和pol RNaseH1和MF-1后随链修复pol 和DNA连接酶pol 和DNA连接酶拓扑异构酶旋转酶Topo 单链结合SSBRF-A四、确保DNA复制忠实性

18、的机制u 半保留复制u DNA聚合酶对模板和引物的识别作用u DNA聚合酶精细的空间结构u DNA聚合酶对碱基的选择作用u DNA聚合酶的校正作用u RNA引物的合成和切除u 错配修复系统1. 逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程。是RNA病毒的复制形式。 五、逆 转 录2. 逆转录酶 (reverse transcriptase) 从RNA病毒中发现，催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，称为依赖RNA的DNA聚合酶(RDDP)p 活性： RNA指导的DNA聚合活性 DNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性（专一水解

19、RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5 3 水解RNA）逆转录酶对DNA无3-5的外切酶活性，因此无校对功能，逆转录的错误率相对较高，这可能是瘤病毒较快出现新病毒株的一个原因。逆转录病毒基因组的复制与基因表达逆转录病毒的复制与表达逆转录病毒基因组复制过程o引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的空载tRNA分子。(一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp为引物，而鼠类逆转录病毒则以宿主细胞tRNAPro为引物)o在逆转录过程中，新合成的DNA链要发生两次“跳跃”，以改变链间碱基配对的位置，使双链DNA的两端产生相同的长末端重复序列LTR 。oLTR中含有整合信号、转录信号（启动子）、增强子和poly A位点等序列，通常只有左侧LTR中的启动子和右侧LTR中的polyA位点发挥正常功能，这是由它们所在的位置所决定的。引物结合于5PB区合成强终止负链DNA合成的负链DNA并不是全长，缺少3U54. 合成冈崎片段不需要（ ）A. dNTP B. DNA连接酶 C. 引物酶 D. DNA聚合酶2. DNA复制时，模板序列是-pTAGA-，将合成的互补结构是（ ）A. -pTCTA- B. -pATCA- C. -pUCUA- D. -pGCGA-1. DNA合成的原料为（合成的原料为（ ）A. dATP、dCTP、dGTP、dT