第七章外源化学物致癌作用

1、1第七章 食品中化学物的致癌作用及评价23教学内容1 基本概念2 致癌物的分类3 化学致癌过程与机制4 致癌性的评价方法41 基本概念 增生：组织或器官细胞通过分裂繁殖而数目增多的现象。 肿瘤：人体器官组织的细胞在外来和内在有害因素的长 期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特 点的新事物。 良性肿瘤和恶性肿瘤 恶性肿瘤：癌、肉瘤、淋巴瘤 化学致癌：化学物质引起或增进正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。 化学致癌物：过去简单定义为引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的化学物质。现在定义为当给从未染过毒的动物染毒一段时间后，和未染毒的对照组相比较时能引起某种组织或细胞肿瘤显著性增加的任何

2、物质。5原癌基因的产物原癌基因：是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。癌基因：细胞基因组中能够使正常细胞发生恶性转化的基因称为癌基因。 6一些原癌基因的产物7 肿瘤抑制基因：又称抗癌基因，在正常细胞中起着抑制细胞增殖、促进细胞分化的作用，一旦发生丢失或功能改变，可导致正常细胞恶性转化。892 化学致癌物10一、化学致癌物的分类(一）国际癌症研究所（2004年）： 组：明确的人类致癌物，95种 组：对人类有致癌能力或致癌能力不确定 A：有致癌能力，66种 B：致癌能

3、力不确定，241种 组：无致癌性物质，497种 组：暂定非致癌物，对人类可能是无致癌物， 1种（己内酰胺）11分类IARC人证据动物证据人类致癌物1充分充分或有限很可能是人类致癌物2A有限或不足充分可能是人类致癌物2B缺乏或不足充分或有限未分类3缺乏或不足不足或缺乏非致癌物4缺乏至少2个物种阴性结果121、遗传毒性致癌物直接致癌物：二甲氨基甲酰氯、 氮芥、烯化环氧化物间接致癌物：黄曲霉毒素B1、多环 芳烃、亚硝胺类、氯乙烯无机致癌物（二）按化学致癌物的作用机制132、非遗传性 致癌物促癌剂激素免疫抑制剂细胞毒物过氧化物酶体增生剂固态物质：塑料、石棉143、暂未确定遗传毒性的致癌物、暂未确定遗传

4、毒性的致癌物 致癌机制尚未清楚致癌机制尚未清楚 如四氯化碳、氯仿、烯烃、硫脲等如四氯化碳、氯仿、烯烃、硫脲等15（三）按致癌物的化学结构（三）按致癌物的化学结构烷化剂：氮芥、烷化剂：氮芥、N亚硝基化合物、硫酸酯、亚硫酸酯亚硝基化合物、硫酸酯、亚硫酸酯多环芳烃类化合物：多环芳烃类化合物：芳香胺类化合物：萘胺、苯胺、氨基联苯胺芳香胺类化合物：萘胺、苯胺、氨基联苯胺氨基偶氮染料：氨基偶氮染料：亚硝胺类化合物：亚硝胺类化合物：黄曲霉毒素：黄曲霉毒素：植物毒素：苏铁素、蕨类毒素植物毒素：苏铁素、蕨类毒素金属致癌物：金属致癌物：16ClCH2CH2ClCH2CH2S硫芥硫芥17（四）根据化学物质对人类的致

5、癌作用分类 （1）肯定对人类有致癌作用的物质：苯、黄曲霉毒素、苯并芘、联苯胺、砷、铬、镍等（2）对人类疑有致癌作用的物质：二氯联苯胺、碱性品红、亚硝胺类化合物、邻二甲基联苯胺等（3）对人类具有潜在致癌能力的物质：铅、汞、四氯化碳、联氨、硫酸甲酯、硫脲等18二、化学致癌物的主要特性（1）致癌作用依赖于化学致癌物的剂量（2）化学致癌物的致癌潜伏期很长（3）致癌作用所引起的细胞变化可遗传到下一代细胞（4）致癌作用可被非致癌因子调控（5）再生能力强的组织易发生恶变（6）化学致癌物的致癌性具有多元性特点19三、化学致癌物的活化与灭活 除少数化学物（如氮芥、环氧化物）有直接致癌作用，大多数须激活才起致癌作

6、用。反应发生在内质网。 各种有活性的致癌物再经历不同的代谢过程转变为弱致癌性或无致癌性的极性化合物排除体外，此过程称作灭活。20eg:多环芳烃（PAH）近致癌物近致癌物21四、化学致癌物作用的靶子 DNA靶子:前癌基因、肿瘤抑制基因 非DNA靶子：作用于纺锤丝系统和作用于与DNA修复或基因表达调控有关的酶系统。223 化学致癌过程与机制一、化学致癌过程与机制*二、多阶段致癌过程中的遗传学改变三、致癌作用的某些生物学特征23正常细胞癌变细胞癌变生物大分子结构与功能异常（DNA ，RNA， Pr）化学致癌剂、环境因素、致癌病毒、放射线外因通过内因作用一、化学致癌过程24化学致癌过程多阶段基因突变学

7、说u肿瘤是由基因突变而导致异常增生的单个细胞，这种异常增生细胞克隆出来的后裔所形成。然而，肿瘤的克隆性起源并不意味着产生肿瘤的原始细胞从一开始就已获得了恶性细胞的所有特征。相反，恶性肿瘤的发生是一个多阶段逐步演变的过程，肿瘤细胞是通过一系列进行性的改变而逐渐变成恶性的。 u从分子生物学的角度，恶性肿瘤可视为基因的疾病，是因某些染色体上的DNA损伤致使基因突变的结果，导致细胞的生长失控、缺乏分化而异常增生，并可侵犯正常组织和器官，最终可散布全身。 25u在这种克隆性演化过程中，常积累一系列的基因突变，可涉及不同染色体上多种基因的变化，包括:癌基因（oncogenes）、肿瘤抑制基因（tumors

8、uppressor genes）、细胞周期调节基因（cell cycle regulator genes）、细胞凋亡基因（cellapoptosis genes）及维持细胞基因组稳定性的基因（包括：DNA修复、DNA复制及染色体分离基因）等。 u从接角致癌剂到癌症的临床症状出现，常有一个相当长的潜伏期，对人的致癌过程中，可长达4-30年之久，平均15-20年，故大多癌症发生在生命的晚期。这也正说明癌症的发生是由多种基因异常在多年的阶段中积累的结果。u致癌过程分为三个阶段：启动期（initiation）,促进期(promotion)和进展（progression）期。这个概念适用于大多数人和实验

9、性致癌情况。 2627启动*癌症的启动：致癌剂在细胞的基因组中引起某些不可逆的变化（突变）。许多基因发生突变：原癌基因和肿瘤抑制基因。在关键的基因中诱发突变，是导致瘤发生的启动事件。2829原癌基因激活30散发性和遗传性Rb功能丧失的机理 31 在肿瘤形成的启动阶段，细胞会出现一些形态学及生物学方面特征性的变化：1）获得不可逆的恒定作为“干细胞”的一种潜能；2）启动细胞与正常细胞相比没有显著的形态学方面的改变；3）对于异源的生物活性物质及化学因子具有很强的敏感性；4）启动细胞能自发形成，而且可以定量分析；5）启动细胞不具有生长自主性，而是具有较正常的分裂增殖能力；6）剂量反应关系无明显的阈值；

10、7）肿瘤启动剂相对强度的确定，依赖于随后促癌阶段局部损伤的程度的大小。32 启动的细胞中染色体的改变很少见，而常见的是一个位点或几个位点上的点突变，这种变化可以自发形成，也可以在致癌剂的诱导下发生，对于一个机体来说这种微小或简单改变的细胞在大多数成熟器官中都是大量存在的。另外，并不是所有的启动细胞最终都能演变为肿瘤，而是部分启动细胞保持在启动阶段，保持静止状态，甚至终生如此。33促进促进剂是通过刺激细胞增生而不是诱发突变而对肿瘤发生起作用，它本身无或仅有极微弱的致癌作用，但反复使用能增加细胞分裂，使启动细胞产生肿瘤发生早期所需的增生细胞群，并可形成良性肿瘤。34INITIATORPROMOTE

11、R RELEASES RESTRAINTS3536 每种促癌剂的作用效应可多样，有学者认为促进作用的主要机制是促癌剂与启动细胞膜上相应的受体分子进行结合，从而激活蛋白激酶C，最终达到对于特定基因有达水平的调控。 在肿瘤形成的过程中，不一定都有明显增加的促癌阶段的存在。 由于促癌剂有阈剂量且其作用是可逆的，可认为这是肿瘤形成过程中较易受干预的阶段，也是最容易取得预防肿瘤成效的部分。37 促癌阶段的细胞具有下列形态学和生物学方面的特征：1）特异基因的表达异学是可逆性的；2）促癌细胞群的存在，依赖于促癌剂的持续作用；3）对衰老、营养及激素等因素的作用非常敏感；4）剂量反应关系具有明显的阈值，促癌剂的

12、最大作用效果依赖于启动剂的暴露量；5）可以根据在持续给予一定量的促癌剂时，启动细胞群数目增加量，分析促癌剂的相对作用强度；6）单独接触促癌剂无效，必须在启动之后持续给予，才可能发生肿瘤。38进展癌症的进展是指由良性肿瘤转变为恶性肿瘤，并进一步演变成更具有恶性表型的肿瘤过程。表现为：自主性和异质性增加，生长加速，侵袭性加强，出现浸润和转移的恶性生物学行为及对抗癌药物的耐药性等。当细胞开始失去维持核型稳定的能力和显示染色体异常时，它们即进入进展期。核型不稳定性的后果不仅可加强肿瘤细胞的生长，而且可引起细胞代谢调节机制的改变，并使肿瘤细胞能逃避机体的免疫监视，及对抗癌药物的耐药性等。3940Myc基

13、因扩增形成双微核（黄色）的核型 41Myc基因扩增形成均染区（黄色）的核型 42 细胞发展为演变细胞的机制：一是肿瘤细胞中原癌基因的扩增或过度表达，使肿瘤细胞获得生长优势，促进了肿瘤细胞的发展；二是抗癌基因的失活。43 癌症的演进阶段的细胞具有以下特征：1）细胞演进阶段的变化是不可逆的；2）细胞的基因组发生显著的改变，可能涉及遗传物质的重大改变，如染色体的结构变异、丢失、易位或嵌入；3）演进阶段早期的细胞对各种环境因子的作用非常敏感；4）演进阶段的细胞已具有良性或恶性肿瘤的特征，如生长速度、侵袭性、转移能力及生化、免疫性能改变等；5）促进细胞发展为演进阶段的细胞时会受到很多肿瘤演进有关因子的调

14、控制；6）演进有时会自发产生。44二、多阶段致癌过程中的遗传学改变1、遗传学改变 致癌物引起细胞的遗传学改变包括基因突变、基因扩增、染色体重排和非整倍性。 一般认为，化学物通过诱发基因突变或染色体突变，导致某一关键基因的可遗传改变对肿瘤的形成是必需的。 肿瘤的发生是癌基因和抑癌基因改变积累的结果。452、非遗传学改变有致癌物用常用致突变试验方法不能检出其致突变性，因此推测非遗传学改变在肿瘤生成中也可能起重要作用。46三、致癌作用的某些生物学特征致癌作用依赖于剂量致癌作用的表达需要时间致癌作用的癌变细胞传代致癌物可被非致癌因子所修饰细胞增生是细胞癌变过程的重要阶段474 致癌性的评价方法一、致癌

15、物的检测方法 1、构效关系分析 2、短期致癌物筛选试验 3、恶性转化试验 4、哺乳动物短期致癌试验 5、哺乳动物长期致癌试验 6、促癌剂的检测二、肿瘤流行病学调查三、致癌物的最终确定和评价 1、致癌物的最终确定 2、致癌危险的定量评价48一、致癌物的检测方法1、构效关系分析构效关系分析多从一种同系物着手，找出该系物质化学结构中与致癌性关系最密切的结构成分，及其它结构成分改变时所产生的影响。构效关系分析结果可靠性的关键在于样本含量，不仅要分析的同系物的总数要充分，而且其中各种类型结构变化的数目也要足够。492、短期致癌物筛选试验、短期致癌物筛选试验通过以致突变试验作为致癌物筛检。致突变试验仅能检

16、测某种因素地致突变性。筛检试验为阳性的受试物，既可能是具有遗传毒性的致癌物，也可能是具有遗传毒性的非致癌物，也不能完全排除致癌性。(1)(1)试验组合试验组合 按照目前对致癌机理的认识，遗传毒性致癌物可能具有多种致癌机理。因此，要求试验组合中尽可能反映较多的遗传学终点。遗传学终点相同的试验往往不能提供更多的信息，在遗传学终点相同的各种试验中应优先选择体内试验。 50试验名称试验材料试验类型观察终点Ames试验细菌体外基因突变骨髓微核试验啮齿类动物体内染色体畸变显性致死试验啮齿类动物体内染色体畸变程序外DNA合成试验哺乳动物细胞体外原发性DNA损伤51(2)(2)筛检试验的可靠性筛检试验的可靠性

17、 在致癌物的快速筛检中，各种致突变试验可靠性的验证，常用一定数量的已知致癌物和已知非致癌物同时进行测定，并以灵敏度和专一性两个指标来衡量其可靠性。灵敏度亦称阳性符合率，即在试验中已知致癌物呈现阳性结果的比例。专一性亦称阴性符合率，是在试验中已知非致癌物呈现阴性结果的比例。对同一遗传学终点的几种体内试验应选择其中灵敏度和特异性好的一种。 52(3)(3)存在问题存在问题 目前常用的致突变试验还不能可靠地检测出：非整倍性或重组所导致的隐性癌基因的纯合子或半合子；可使癌基因截短的重组；能活化原癌基因的基因扩增；线粒体DNA突变。这些单独或组合的改变可能是致癌机理之一，因此改进或建立新的致突变试验，适

18、应对致癌物进行筛检的需要，具有重要实际意义。 533 3、恶性转化试验恶性转化试验 恶性转化试验又称细胞转化试验，与淋巴细胞转化试验有别。细胞转化是指对培养细胞诱发与肿瘤形成有关的表型改变。此种表型改变是因致癌物所致核型改变的结果，其改变包括细胞形态、细胞生长能力、生化表型等变化，以及移植于动物体内形成肿瘤的能力。进行恶性转化试验的目的在于揭示体外培养细胞接触受试物后，细胞生长自控能力的丧失的某些机理。生长自控能力表现为接触抑制，在液体培养基中的细胞贴壁后，正常克隆为单层且排列有序的细胞；而转化克隆为多层且排列紊乱。恶性转化细胞偏大且大小不等、核大而畸形、染色质深染而粗糙、核浆比例倒置、核膜粗

19、厚、核仁增生而肥大。核仁和胞浆均由于RNA增多而偏酸性，故呈嗜碱性染色而偏蓝，核分裂多见。 5455 目前恶性转化试验可按所用的细胞分为三类： (1)(1)原代或早代细胞原代或早代细胞 常用叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHE细胞)、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等。 (2)(2)细胞系细胞系 常用 BALBC-3T3、C3H10T12和BHK-21。 (3)(3)病毒感染细胞病毒感染细胞 常用RLVRE细胞即劳舍尔氏白血病病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞和SA7/SHE细胞即猿猴腺病毒感染的SHE细胞。 本试验的观察终点是细胞的恶性变，如将此种细胞移植于动物体内可形成肿瘤。因此，其可靠

20、性超过致突变试验，但仍存在假阳性和假阴性问题。564 4、哺乳动物短期致癌试验、哺乳动物短期致癌试验 又称有限动物试验(limited in vivo biossay)，即指在有限的短时间内完成而不是终生，并且观察的靶器官限定为一个而不是全部器官和组织的哺乳动物致癌试验。国内外目前较受重视的哺乳动物短期致癌试验有四种：小鼠肺肿瘤诱发试验、雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验、大鼠肝转变灶(altared focus)试验和小鼠皮肤肿瘤诱发试验。由于肺和肝是最常见的发生肿瘤器官，也是许多致癌物的靶器官。至于小鼠皮肤肿瘤与SD大鼠乳腺癌两种试验，仅适用于部分类型的化学物质。 57 进行这些试验时，除特定要求

21、外，应遵从长期动物致癌试验的一般要求。上述任一试验的阳性结果，其意义与长期动物致癌试验相当。由于实验期短，又未检查其它器官和系统，特别是皮肤肿瘤和乳腺癌的诱发试验似乎仅适用于较小范围的化学物质类型，所以哺乳动物短期致癌试验阴性结果的意义较差。585 5、哺乳动物长期致癌试验、哺乳动物长期致癌试验 哺乳动物长期致癌试验亦称哺乳动物终生试验，是目前公认的确证动物致癌物的经典方法，较为可靠。用此法评定化学致癌性有许多优点。因为化学致癌的一个最大特点是潜伏期长，在啮齿动物进行12年的试验即相当于人类大半生的时间。而如果采用流行病学调查方法来确证一种新化学物是否为致癌物，一般需要人类接触受试物20年后才

22、能进行。此外，动物试验能严格控制实验条件，而流行病学调查不易排除混杂因素的影响。 59 (1)(1)动物选择动物选择 在致癌试验中, 选择动物最重要的是对诱发肿瘤的易感性。除考虑物种、品系、年龄和性别、自发肿瘤率较低外，选择具有特定靶器官的物种尤为重要；小鼠对肝肿瘤的易感性与大鼠相近，但肝癌自发率较高，易患各种肝脏疾病。新生动物比年龄稍大者对致癌和一般毒性敏感，但易患其它感染疾病，死亡率较高。 实际工作中多使用断乳或断乳不久的动物,一般是雌雄各半。除非已证明该受试物结构近似的致癌物有易感性性别差异，才选择易感的性别。 60 (2)(2)动物数量动物数量 致癌作用是严重损害健康的一种效应，因此试

23、验中应尽量设法避免假阴性结果，所以每组动物数应较一般毒性试验为多。如对照组肿瘤自发率越高，而染毒组肿瘤发生率越低，则所需动物数越多。 61 (3)(3)剂量设计剂量设计 为观察到剂量反应关系一般使用三个剂量，最少两个剂量。较低剂量为前一级较高剂量的1/3至1/4，最低剂量最好相当于或低于人类实际可能接触的剂量。最高剂量应尽可能加大，但又不致死，这样才不致于漏检致癌物。美国国家癌症研究所推荐的最高剂量应为最大耐受剂量（MTD）。理想的MTD非但不应致死，也应不缩短寿命，与对照组相比，体重下降不大于10%。 因此，必须通过预试来设计一个估计的最大耐受量（EMTD）。根据急性试验的LD50或LD01

24、，设计14天亚急性试验，以确定亚急性MTD；之后再设计90天的亚慢性试验，确定亚慢性MTD，然后选择稍低剂量作为终生试验的EMTD。62(4)(4)实验期限与染毒时间实验期限与染毒时间 原则上实验期限要求长期或终生。所谓长期，因不同物种寿命长短不一，观察时间要求不同。一般情况下小鼠最少1.5年，大鼠2年；可能时分别延长至2年和2.5年。一般主张染毒直至试验结束。63 (5)(5)结果的观察、分析和评定结果的观察、分析和评定 实验过程中每天密切观察动物12次，及时发现濒死动物并进行病理学解剖。发现第一例肿瘤时存活的动物数，作为试验终结时的有效动物数，各种分析指标都以此为基数计算。当然有效动物应符

25、合试验设计要求。体表及体内各组织器官均应肉眼观察，找出可疑肿块，并进行组织病理学检查。主要分析指标如下：64A A肿瘤发生率肿瘤发生率 肿瘤发生率是最重要的指标，需要计算肿瘤总发生率、恶性肿瘤总发生率、各器官或组织肿瘤发生率和恶性肿瘤发生率，以及各种类型肿瘤发生率。B B多发性多发性 多发性是指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。一般计算每一组的平均肿瘤数。有时还可计算每一组中出现2个、3个或多个肿瘤的动物数或比例。肿瘤的多发性是化学致癌的又一特征。C C潜伏期潜伏期 从接触致癌物到用各组出现第一个肿瘤的时间作为该组的潜伏期。这种办法只适用于能在体表观察的肿瘤，如皮肤肿瘤或乳腺肿瘤。对

26、于内脏肿瘤的潜伏期，则需分批剖杀，计算平均潜伏期。65 分析以上三种指标时应首先注意有无剂量-反应关系。染毒组应与对照组作显著性检验(单侧)。存在剂量-反应关系并与对照组差异显著时，判定为阳性结果。如染毒组发生的肿瘤类型在对照组未出现，也作为阳性结果，但此时的对照组应当有历史对照资料。 阳性结果的评定应当慎重。在较高剂量才与对照组间出现显著差异，不如在较低剂量下或在人类可能实际接触的剂量出现显著差异的意义重大。66(6)(6)阴性结果的确定阴性结果的确定 要使长期动物致癌试验的阴性结果得到承认，一般应满足试验设计的最低要求：两个物种、两种性别、至少三个剂量水平且其中一个接近MTD、每组有效动物

27、数至少50只。如将动物数增至每组100只，则假阴性概率可下降，继续增加每组动物数，可进一步降低假阴性概率。因此，即使符合最低要求得到阴性结果时，特别是当存在一定的剂量反应关系时，阴性结果不一定说明该受试物不致癌，仅能表明，该受试物在该特定染毒剂量下不引起肿瘤净增率超过染毒组的肿瘤净增率。67 6 6、促癌剂的检测、促癌剂的检测 在哺乳动物长期致癌试验中，有时检出的是促癌剂，但在该试验中不能与其它类型的致癌物相区分。前述哺乳动物短期致癌试验的4种方法中，除大鼠乳腺癌诱发试验外，其余3种都适用于促癌剂的检测。具体方法是选用适当的启动剂，启动后l2周开始用受试物染毒。对于启动剂，在小鼠皮肤肿瘤后诱发

28、试验中可用多环芳烃类，在小鼠肺肿瘤诱发试验中可用氨基甲酸乙酯；在大鼠肝转变灶诱发试验中可用二甲苯并蒽，启动剂的剂量应较低，单独使用时不应引起或仅引起很少肿瘤形成。 68 由于不少促癌剂可能存在器官特异性，所以有时难于在三种试验中作出正确的选择。从这个角度看，体外试验也许更好，因为此时受试物直接与细胞接触，而不会表现出亲器官的特性。有两个试验稍加更改即可被应用，即恶性转化试验和哺乳动物细胞正向突变试验。69二、肿瘤流行病学调查二、肿瘤流行病学调查 分析性流行病学调查是确定人类致癌物主要的手段之一。进行分析流行病学调查时，一般是先通过动物肿瘤诱发试验，根据阳性结果检出潜在的人类致癌物，或先进行描述

29、性流行病学调查或临床观察发现怀疑某种人类致癌物后才进行。可按不同情况酌情选用定群调查(或称队列调查)和病例对照调查。在两种调查中都可利用肿瘤患者的资料，对接触与不接触受试物人员的发瘤年龄和死于肿瘤年龄进行分析比较。70 肿瘤流行病学调查的结果为阳性时，并且能够重复，即另一同样调查也得出阳性结果并有剂量-反应关系，又可得到动物实验的验证，则其意义较大。该受试物较易被承认为人类致癌物。肿瘤流行病学调查结果如为阴性, 也不能完全确定受试物为非致癌物，仅能认为本观察到致癌作用的接触条件(剂量和时间)的上限。因此，当接触年限较短或剂量较低时，流行病学调查的阴性结果不能否定对同一受试物进行另一凋查的阳性结果。任何肿瘤流行病学调查，必须设计周密严谨，否则无论阳性结果或阴性结果的意义均将大为降低。71三、致癌物的最终确定和评价三、致癌物的最终确定和评价1 1、致癌物的最终确定、致癌物的最终确定 对于外源化学物化学结构的分析或致突变性测试，仅能达到确定何种受试物应优先进行动物致癌试验，其结果并不能作为受试物是否具有致癌作用的依据。 72 由于通过动物致癌试验确定的致癌物，迄今只有极少数量（约34种）经过肿瘤流行病学调查证实并在国际上得到公认为对人类致癌。所以确定致癌物时应分为人类致癌物和动物致癌物。将有充分证据证实对动物致突变的