综合性实验一 质粒DNA的小量制备和电泳鉴定 ppt课件

1、综合性实验二综合性实验二 质粒质粒DNADNA小量制备和电泳小量制备和电泳鉴定鉴定一实验目的一实验目的1 1掌握碱变性裂解法制备质粒掌握碱变性裂解法制备质粒DNADNA的原理。的原理。2 2了解质粒了解质粒DNADNA的性质和用途。的性质和用途。3. 3. 掌握掌握DNADNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。4. 4. 掌握质粒掌握质粒DNADNA闭环和开环构型的电泳分闭环和开环构型的电泳分别鉴定。别鉴定。质粒质粒 plasmid质粒是细菌染色体外的环质粒是细菌染色体外的环形双链形双链DNA分子，能在宿分子，能在宿主细胞内独立自主的进展主细胞内独立自主的进展复制。复制。

2、质粒质粒基因工程中基因工程中目的基因的目的基因的运载工具。运载工具。质粒载体质粒载体大小可从大小可从1kb1kb到到200kb200kb挑选标志挑选标志多克隆位点多克隆位点酶切位点酶切位点复制原点复制原点质粒的特性：质粒的特性： 能独立自主进展复制。能独立自主进展复制。 细菌内的共生型遗传细菌内的共生型遗传因子，能垂直遗传。因子，能垂直遗传。 能赋予宿主细胞一些能赋予宿主细胞一些表型。表型。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如分开宿主细胞那么不能存活，而宿主和蛋白质，如分开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。即

3、使没有它们也可以正常存活。质粒的运用质粒的运用质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的运用价值。在基因工程中具有极广泛的运用价值。大多数来自细菌的质大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺环状的分子，以超螺旋方式存在。旋方式存在。Visualization of topoisomers. In t h i s e x p e r i m e n t , a l l D N A molecules have the s

4、ame number of base pairs but exhibit some r a n g e i n t h e d e g r e e o f s u p e r c o i l i n g . B e c a u s e supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules, they migrate more rapidly during gel electrophoresis.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n琼脂糖是由琼脂分别制备的链状多糖。其构造琼脂糖是由琼脂分别制备的链状多糖。其构造单元是单元是D

5、-半乳糖和半乳糖和3.6-脱水脱水-L-半乳糖。许多琼半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其相互环绕构脂糖链依氢键及其它力的作用使其相互环绕构成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。n因此该凝胶适宜于核酸与核蛋白、免疫复合物因此该凝胶适宜于核酸与核蛋白、免疫复合物的分别、鉴定及纯化。在临床生化检验中也常的分别、鉴定及纯化。在临床生化检验中也常用于用于LDH、CK等同工酶的检测。等同工酶的检测。 影响电泳迁移率的要素：FrictionCharge外加电流、电压分子量 分子外形分子的等电点VoltageCATHODEANODE+-+琼脂糖凝胶电泳分别核酸的根本技术

6、琼脂糖凝胶电泳分别核酸的根本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNADNA分子的电泳迁分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；移率与其分子量的常用对数成反比； 分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNADNA直线直线DNADNA开环双链开环双链DNADNA。 当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNADNA球形球形不能进入胶中，相对迁移率为不能进入胶中，相对迁移率为0 0，而同等大小的直线，而同等大小的直线DNADNA刚性棒状可以按长轴方向前移，相对迁移率大于刚性棒状可以按长轴方向前移，

7、相对迁移率大于0 0。 差速离心差速离心DIFFERENTIAL DIFFERENTIAL CENTRIFUGATIONCENTRIFUGATION二实验原理二实验原理质粒提取原理质粒提取原理质粒提取有多种方法，但都包含三个根本步骤：质粒提取有多种方法，但都包含三个根本步骤：1. 培育细菌使质粒扩增培育细菌使质粒扩增2. 搜集裂解细菌搜集裂解细菌3. 分别纯化质粒分别纯化质粒DNA去除蛋白质去除蛋白质去除去除RNA去除基因组去除基因组DNA苯酚苯酚-氯仿抽提法氯仿抽提法Rnase消化法消化法？质粒质粒DNA和基因组和基因组DNA的区别的区别大小不同大小不同变性与复性有差别变性与复性有差别质粒质

8、粒DNA较小，通常只较小，通常只需基因组需基因组DNA分子量的分子量的百分之一。百分之一。基因组基因组DNA容易断裂线容易断裂线性化。性化。 从大肠杆菌中分别质粒从大肠杆菌中分别质粒DNADNA方法众多，目前方法众多，目前常用的有：常用的有： 根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及构造等特点选择。成及构造等特点选择。 碱变性法既经济且收得率较高碱变性法既经济且收得率较高, ,提取的质粒提取的质粒DNADNA可用于酶切可用于酶切, ,衔接与转化。衔接与转化。分别质粒分别质粒DNA和基因组和基因组DNA的方法的方法碱变性法碱变性法煮沸法煮沸法羟基磷灰石层析

9、法等羟基磷灰石层析法等碱裂解法提取质粒的原理碱裂解法提取质粒的原理 运用最为广泛的制备质粒运用最为广泛的制备质粒DNADNA的方法。的方法。 基于染色体基于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性与复性的差的变性与复性的差别而到达分别目的。别而到达分别目的。原理：原理：1. 1. 强碱强碱NaOHNaOH和和SDSSDS裂解细菌，细菌中的质粒裂解细菌，细菌中的质粒DNADNA和基因组和基因组DNADNA在强碱条件下发生变性。在强碱条件下发生变性。2. 2. 怎样去除基因组怎样去除基因组DNADNA？当参与酸性物质进展中和时，质粒当参与酸性物质进展中和时，质粒DNADNA很快复很快复性，

10、而染色体性，而染色体DNADNA那么和变性蛋白质等缠绕在那么和变性蛋白质等缠绕在一同，难以复性，并构成沉淀，经过离心随细一同，难以复性，并构成沉淀，经过离心随细胞碎片一同去除。胞碎片一同去除。3. 3. 怎样去除蛋白质？怎样去除蛋白质？ 留有质粒留有质粒DNADNA的上清，经酚的上清，经酚/ /氯仿去除蛋白质氯仿去除蛋白质后，用乙醇沉淀后，用乙醇沉淀DNADNA，即得到质粒，即得到质粒DNADNA。三、试剂与仪器三、试剂与仪器BiospinBiospin质粒质粒DNADNA小量提取试剂盒：小量提取试剂盒：Resuspension buffer, Lysis buffer, Neutraliza

11、tion Resuspension buffer, Lysis buffer, Neutralization buffer, wash buffer, Elution buffer, RNase buffer, wash buffer, Elution buffer, RNase solution, Spin columns.solution, Spin columns.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，电泳槽，紫外灯电泳仪，电泳槽，紫外灯琼脂糖，琼脂糖，50XTAE50XTAE电泳缓冲液，电泳缓冲液，6X6X点样缓冲液，点样缓冲液，DNA DNA MarkerMarker，溴化乙啶荧光

12、染料，结合，溴化乙啶荧光染料，结合DNADNA并在紫外并在紫外线下显示线下显示四、操作步骤四、操作步骤Resuspension Buffer 细胞悬浮液细胞悬浮液Lysis Buffer 碱裂解液碱裂解液Neutralization Buffer 中和液中和液Spin column 吸附柱吸附柱Wash Buffer 漂洗液漂洗液Elution Buffer 洗脱缓冲液洗脱缓冲液2. 2. 质粒质粒DNA DNA 的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 1) 1) 用胶带将洗净、枯用胶带将洗净、枯燥的配胶板的边缘封住燥的配胶板的边缘封住，构成一个胶模并程度，构成一个胶模并程度放置，放入电泳梳。放置，

13、放入电泳梳。2) 2) 按程度板的长按程度板的长宽宽0.5cm0.5cm胶厚，量取胶厚，量取1 1TAETAE，并按并按0.80.8的浓度称取琼脂糖的浓度称取琼脂糖agaroseagarose，在微，在微波炉或电炉上加热至全熔清澈透明。波炉或电炉上加热至全熔清澈透明。3) 等凝胶温度降至大约等凝胶温度降至大约5060以下时，参与以下时，参与1 mg/L溴溴化乙锭化乙锭EB至终浓度为至终浓度为0.5g/mL ；摇匀并轻快地倒；摇匀并轻快地倒入程度板中，除掉气泡。入程度板中，除掉气泡。4) 凝固后，将梳子悄然拔出。凝固后，将梳子悄然拔出。5) 去掉胶带，将程度板放入加有去掉胶带，将程度板放入加有1TAE电泳缓冲液的电电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。6) 6) 上样上样Buffer Buffer 和和DNA DNA 混匀后点样，记录点样次序。混匀后点样，记录点样次序。7) 7) 在程度板两边的点样孔中分别参与