第二章核酸化学下ppt课件

1、核酸化学核酸化学RNA的构造和功能的构造和功能 大多数天然大多数天然RNA分子是一条单链分子是一条单链 部分区域构成如部分区域构成如DNA那样的双螺旋构造，那样的双螺旋构造，按照按照A-U，G-C进展配对，不能配对的碱进展配对，不能配对的碱基那么构成环状突起，参与螺旋构成的核基那么构成环状突起，参与螺旋构成的核苷酸约占苷酸约占4070% RNA主要有主要有mRNA、rRNA和和tRNA三大类，三大类，还包括一些小分子还包括一些小分子RNA如核内小分子如核内小分子RNAsnRNA、反义、反义RNA(asRNA)等等tRNA、rRNA和和mRNA的比较的比较RNA类类型型相对含量相对含量（%）沉降

2、系数沉降系数（S）分子量分子量（kd)分子长度分子长度（b)rRNAtRNAmRNA801552316541.2x1085.5x1043.6x1012.5x101范围很大范围很大3,7001,70012075大肠杆菌中的大肠杆菌中的RNAtRNA tRNA主要作用是将氨基酸转运到核糖体主要作用是将氨基酸转运到核糖体-mRNA复合物的相应位置用于蛋白质合成复合物的相应位置用于蛋白质合成 20种根本氨基酸每一种都至少有一种种根本氨基酸每一种都至少有一种tRNA tRNA分子较小，平均沉降系数为分子较小，平均沉降系数为4S 大多数大多数tRNA分子具有类似的三叶草二级构分子具有类似的三叶草二级构造造

3、tRNA三叶草二级构造三叶草二级构造7617:11720:120184747:147:1617168975746661534948444339312710251322657273IIIIIIIV可有可无可有可无 可变可变固定固定可变环可变环(variable loop)反密码子环反密码子环(anticodon loop)D环环(D loop)TC环环(TC loop)受体端受体端(acceptor stem)5-3-The basic principle of translationtRNA中常见的修饰核苷中常见的修饰核苷N1NHOO二氢尿嘧啶核苷(D)NNON9NH3C1-甲基次黄嘌呤核苷(

4、m1I)HNNON9NNH3CCH3N2,N2-二甲基鸟嘌呤核苷(m22G)HNC5NHOORiboseRiboseRiboseRiboseN1NHOORiboseH3C假尿苷( )胸腺嘧啶核苷(T)酵母丙氨酸酵母丙氨酸-tRNA的核苷酸序列的核苷酸序列AOHCCACCUGCUCAGGCCUCCGGpGGGCGGUUGUGCGGCGCAGDCGGDAm2G2CUCCCGAGGGUUIGCm1I CDGGAU UAGC TT m1Im2G2D1-甲基次黄苷甲基次黄苷假尿苷假尿苷胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷N2N2-二甲基鸟苷二甲基鸟苷5,6-二氢尿苷二氢尿苷5-3-酵母苯丙氨酸酵母苯丙氨酸-tRNA

5、三级构造三级构造(1)rRNA rRNA主要分布在核糖体主要分布在核糖体(ribosome)内内 核糖体由约核糖体由约40%的蛋白质和的蛋白质和60%的的rRNA组成，组成，rRNA占细胞占细胞RNA总量的总量的80% 核糖体由大小不同的两个亚基组成，每个核糖体由大小不同的两个亚基组成，每个亚基含有不同的亚基含有不同的rRNArRNA原核生物原核生物真核生物真核生物核糖体核糖体rRNA核糖体核糖体rRNA70 S(30 S, 50 S)16 S5 S, 23 S80 S(40 S, 60 S)18 S5 S, 5.8 S,28 S核糖体和所含的核糖体和所含的rRNA原核生物的核糖体和原核生物的

6、核糖体和rRNA70 S ribosome31 protein21 protein23 S rRNA5 S rRNA16 S rRNA+大肠杆菌大肠杆菌16S rRNA二级构造二级构造生物的分类生物的分类1动物动物植物植物E. coli极端嗜热菌极端嗜热菌Archaebacteria古细菌古细菌Eubacteria真细菌真细菌Eukaryotes真核生物真核生物不同种系的不同种系的16S rRNA的二级构造的二级构造mRNA 约占细胞总约占细胞总RNA的的3%5%，代谢活泼，代谢活泼，寿命较短，分子长度变化很大寿命较短，分子长度变化很大 mRNA的核苷酸序列决议相应蛋白质的氨的核苷酸序列决议相

7、应蛋白质的氨基酸序列基酸序列 原核生物原核生物mRNA的转录和翻译在细胞同一的转录和翻译在细胞同一空间进展空间进展 真核生物真核生物mRNA的前体包括内含子和外显的前体包括内含子和外显子，经加工后变为成熟的子，经加工后变为成熟的mRNA，指点蛋，指点蛋白质合成白质合成RNA的其他功能的其他功能 RNA在在DNA复制、转录、翻译中均有一定复制、转录、翻译中均有一定的调控作用，与细胞内或细胞间一些物质的调控作用，与细胞内或细胞间一些物质的运输和定位有关的运输和定位有关 1981年年Cech发现了发现了RNA的催化作用，并提的催化作用，并提出核酶出核酶ribozyme) 的概念，彻底改动了的概念，彻

8、底改动了以往酶只需蛋白质的观念以往酶只需蛋白质的观念Tetrahymena rRNA前体自剪切前体自剪切UpCpUpApApApGpUpApAp53UpCpUpGpUpApAp53ApApApIntervening sequence (IVS)pGOHUpCpUOH-3GpUpApAp535-pGpApApAp5UpCpUpUpApAp3GOH-35-pGpApApAp+form loop at IVSPre-rRNAattacked by GOHrRNAIVS3 U attacks 3 end of IVSL-19 IVSfurther losing19 residues19-IVS 作为催

9、化剂作为催化剂GpGpGpApGpGOH-5GOH-3CpCpCpCpCOHC5GpGpGpApGpGOH-5GOH-35-CpCpCpCpCOH-3CpCpCpCOHC4GpGpGpApGpGOH-5GpCOH-3GpGpGpApGpGOH-5GpCOH-3CpCpCpCpCOHC5CpCpCpCpCOH-3CpCpCpCpCpCOHC6核糖核酸酶核糖核酸酶P的催化作用的催化作用 核糖核酸酶核糖核酸酶P(Ribonuclease P)是由两部分是由两部分组成的，一部分是组成的，一部分是377个核苷酸的个核苷酸的RNA分分子，另一部分是分子量约为子，另一部分是分子量约为20,000的蛋白的蛋白

10、质。两部分都是其催化活性所必需的，但质。两部分都是其催化活性所必需的，但是在非生理条件下是在非生理条件下RNA部分能单独完成其部分能单独完成其催化断裂的功能催化断裂的功能S. Altman, 1989, Nobel Lecture细胞中的信息流细胞中的信息流and biochemicalcatalysisDNARNAProteingeneticinformationgenetic informationstructure and biochemical catalysisThe RNA WorldThe RNA World HypothesisAll life that is known to

11、 exist on Earth today and all life for which there is evidence in thegeological record seems to be of the same form one based on DNA genomes andprotein enzymes. Yet there are strong reasons to conclude that DNA- and protein-basedlife was preceded by a simpler life form based primarily on RNA. This e

12、arlier Era is referred to as the RNA world, during which the genetic information resided in the sequence of RNA molecules and the phenotype derived from the catalytic properties ofRNA. Gerald F. Joyce核酸的性质核酸的性质 普通理化性质普通理化性质 核酸的紫外吸收性质核酸的紫外吸收性质 核酸构造的稳定性核酸构造的稳定性 核酸的变性核酸的变性 核酸的复性核酸的复性 分子的杂交分子的杂交核苷酸的酸性核苷

13、酸的酸性POHOROHPOHORO-PO-ORO-PhosphateBasepKa1pKa25-AMP5-GMP5-UMP5-CMP0.90.71.00.86.16.16.46.3pKa3.82.49.49.54.5N-1N-7N-1N-3N-3-H+ H+-H+ H+核苷酸属两性电解质，通常表现为酸性核苷酸属两性电解质，通常表现为酸性核酸的性质核酸的性质普通理化性质普通理化性质 核酸微溶于水，不溶于普通有机溶剂，常核酸微溶于水，不溶于普通有机溶剂，常用乙醇作沉淀剂用乙醇作沉淀剂 核酸可被酸、碱或酶水解，可用层析、电核酸可被酸、碱或酶水解，可用层析、电泳等方法分别。泳等方法分别。核酸的性质核酸

14、的性质紫外吸收性质紫外吸收性质 核酸中的嘌呤和嘧啶环在核酸中的嘌呤和嘧啶环在260-290nm紫外紫外波段有很强的吸收，最大吸收峰在波段有很强的吸收，最大吸收峰在260nm附近，常用此性质来检测核酸附近，常用此性质来检测核酸 DNA和和RNA的紫外吸收光谱差别不大的紫外吸收光谱差别不大 核酸的紫外吸收值比其各核苷酸的紫外吸核酸的紫外吸收值比其各核苷酸的紫外吸收值之和少收值之和少3040%减色效应。减色效应。UV spectra of ribonucleotides核酸的性质核酸的性质构造稳定性构造稳定性 碱基对间的氢键碱基对间的氢键 碱基堆积碱基堆积碱基堆积力对维持核酸的空间碱基堆积力对维持核

15、酸的空间构造起主要作用构造起主要作用 环境中的正离子环境中的正离子环境中的环境中的Na+、K+、Mg2+、Mn2+等离子，可消除核酸中磷酸等离子，可消除核酸中磷酸基间的静电斥力，对核酸构造的稳定有重基间的静电斥力，对核酸构造的稳定有重要作用要作用核酸的性质核酸的性质变性变性 变性的概念变性的概念核酸双螺旋区氢键断裂，空核酸双螺旋区氢键断裂，空间构造被破坏，构成单链无规线团形状的间构造被破坏，构成单链无规线团形状的过程。过程。 热变性和热变性和TmDNA的稀盐溶液在加热下的稀盐溶液在加热下发生变性，在某一温度附近，发生变性，在某一温度附近，260nm的吸的吸光度骤然添加，其添加量到达最大增量一光

16、度骤然添加，其添加量到达最大增量一半时的温度称为熔解温度半时的温度称为熔解温度Tm核酸的变性核酸的变性Native DNAHeatCool slowlyDenatured DNA核酸变性过程的紫外吸收核酸变性过程的紫外吸收Tm时紫外吸收突变时紫外吸收突变影响影响Tm的要素的要素 G-C对含量对含量G-C含量愈高，含量愈高， Tm 愈高愈高 溶液的离子强度溶液的离子强度离子强度低，离子强度低， Tm 较低较低 溶液的溶液的pH pH11.3 时，时， DNA完全变性；完全变性； pH5时，时， DNA易脱嘌呤易脱嘌呤 变性剂变性剂甲酰胺、尿素和甲醛等可破坏氢甲酰胺、尿素和甲醛等可破坏氢键，妨碍碱

17、基堆积，使键，妨碍碱基堆积，使Tm下降下降Tm与具有不同与具有不同G-C含量的生物含量的生物离子强度和离子强度和G-C含量对含量对Tm的影响的影响核酸的复性核酸的复性 复性复性变性核酸的互补链在适当条件下重变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。新缔合成双螺旋的过程。 变性核酸复性时变性核酸复性时需缓慢冷却，需缓慢冷却， 故又称退火故又称退火 Tm-25是较适宜的复性温度是较适宜的复性温度Denature and renature影响复性的要素影响复性的要素 单链片段浓度单链片段浓度 单链片段长度单链片段长度 片段内的反复序列片段内的反复序列 溶液离子强度溶液离子强度分子杂交分子杂

18、交 分子杂交分子杂交不同来源的不同来源的DNA互补区构成双互补区构成双链，链， 或或DNA单链和单链和RNA链的互补区构成链的互补区构成DNA-RNA杂合双链的过程杂合双链的过程 分子杂交广泛运用于基因定位、确定生物分子杂交广泛运用于基因定位、确定生物的遗传进化关系等的遗传进化关系等分子杂交技术分子杂交技术 Southern印迹法印迹法将电泳分别后的将电泳分别后的DNA片片段从凝胶转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，段从凝胶转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上， 再进展杂交的技术再进展杂交的技术 Northern印迹法印迹法将电泳分别后的变性将电泳分别后的变性RNA吸印到纤维素膜上再进展分子杂交的吸印到纤维素膜上再进展分子杂交的技术技术 杂交技术和杂交技术和PCR技术的结合，可检出含量技术的结合，可检出含量极少的极少的DNASouthern Blot凝胶电泳分析凝胶电泳分析RNA实例实例核酸的序列测定核酸的序列测定 Gilbert提出的化学法提出的化学法 Sanger提出的酶法提出的酶法 酶法根底：酶法根底：1凝胶电泳可分别仅差一个凝胶电泳可分别仅差一个核苷酸的核苷酸的DNA片断；片断；2用适宜的引物和用适宜的引物和聚合酶可以在试管内合成单链聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的模板的互补链；互补链；32,3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸(dd