基因工程相关技术

1、基因工程相关技术酶切目的基因载体M琼脂糖凝胶回收技术目的基因线性载体连接反应感受态大肠杆菌转化电泳技术筛选鉴定重组载体引言引言第1页/共46页本章内容 核酸的琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 感受态大肠杆菌的制备第2页/共46页第3页/共46页琼脂糖凝胶电泳原理与操作第4页/共46页核酸的琼脂糖凝胶电泳注意事项准备干净的配胶板和电泳槽准备干净的配胶板和电泳槽 选择电泳方法选择电泳方法 适合的电泳缓冲液适合的电泳缓冲液 电泳的合适电压和温度电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察凝胶的染色和观察 正确选择凝胶浓

2、度正确选择凝胶浓度 第5页/共46页准备干净的配胶板和电泳槽准备干净的配胶板和电泳槽注意注意:DNA酶污染的仪器可能会降解酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象第6页/共46页选择电泳方法选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 第7页/共46页适合的电泳缓冲液适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能

3、力。电泳缓冲液配制第8页/共46页正确选择凝胶浓度正确选择凝胶浓度 浓度通常在0.52之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。 第9页/共46页电泳的合适电压和温度电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30。 注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 第10页/共46页DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。 注意变性的DNA样品可能导致条带

4、模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 第11页/共46页 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。DNA的上样 第12页/共46页Marker的选择 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。第13页/共46页凝胶的染色和观察凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed

5、，虽然毒性小，但价格昂贵。 第14页/共46页本章内容 核酸的琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 感受态大肠杆菌的制备第15页/共46页第16页/共46页PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（）第17页/共46页PAGE注意事项注意事项 （1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 （3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。 （4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。第18页/共46页本章内容 核酸的琼脂糖凝胶电泳

6、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 感受态大肠杆菌的制备 基因组DNA的提取与纯化 RNA的提取与cDNA合成第19页/共46页第20页/共46页琼脂糖凝胶DNA片段的回收操作流程操作流程切胶融胶电转电泳离心硝酸纤维膜洗脱目的基因线性载体第21页/共46页本章内容 核酸的琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 感受态大肠杆菌的制备 基因组DNA的提取与纯化 RNA的提取与cDNA合成第22页/共46页第23页/共46页大肠杆菌Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理感受态大肠杆菌：在基因工

7、程操作过程中，我们把处于易接收外源状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌DNA分子DNA分子Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+第24页/共46页经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易接收外源状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌DNA分子感受态大肠杆菌Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2

8、+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+DNA分子钙磷复合物第25页/共46页 用天平准确称取下列物品并置入一个洁净的100毫升三角烧瓶中: 胰蛋白胨 1g 浓缩酵母浸出粉 0.5g NaCl 0.5g 1.5g的琼脂粉第26页/共46页 在烧瓶中置入一磁力搅拌棒并加入100毫升ddH2O溶解上述物质,然后磁力搅拌混匀. 用棉塞塞住瓶口,并用牛皮纸封住扎紧后,将烧瓶于120消毒20min.第27页/共46页 消毒结束后, 在超净工作台内将培养基倒入消过毒的平皿中(培养基的厚度为35毫米). 侍培养基冷却凝固后,于4中保存备用.第28页/共46页

9、细菌划线培养 取一块无抗菌素的LB平板培养基,在超净工作台内,用细菌接种环挑取细菌,于培养基上作蛇形画线.第29页/共46页细菌划线培养 将平板置入37培养箱中倒置培养1216小时,然后取出观察有无菌落长出.第30页/共46页 从37培养1620h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的1620h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中。于37振摇培养约23h（旋转摇床200300r/min），每隔2030min测量OD600值0.4。第31页/共46页 1. 在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷 的 50ml聚丙烯离心管中，冰上放置10

10、20min 2. 于44000转 /分离心10min，回收细菌细胞 3. 将管倒置1min，以使最后残留的痕量培养液流尽50403020504030205040302050403020离心第32页/共46页5. 以10ml用冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，放于冰上 ， 44000转 /分离心10min，回收细菌细胞；6 .每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2 (内含15%甘油)重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70贮存备用。5040302050403020离心100ul/管分装低温冻存第33页/共46页注意事项1. 所用器具的洁净程度第3

11、4页/共46页 5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。5040302020分钟后离心100ul/管分装注意事项注意事项 第35页/共46页 6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用注意事项注意事项第36页/共46页 7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。 注意事项注意事项第37页/共46页 8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱。注意事项注意事项第38页/共46页第39页/共46页酶切目的基因载体M琼脂糖凝胶回收技术目的基因线性载体连接反应感受态大肠杆菌转化电泳技术筛选鉴定重组载体引言引言第40页/共46页准备干净的配胶板和电泳槽准备干净的配胶板和电泳槽注意注意:DNA酶污染的仪器可能会降解酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象第41页/共46页准备干净的配胶板和电泳槽准备干净的配胶板和电泳槽注意注意:DNA酶污染的仪器可能会降解酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象第42