第二章沉淀法

1、第二章第二章 沉淀法沉淀法n什么是沉淀法？什么是沉淀法？n沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？n常用的沉淀方法包括哪些？常用的沉淀方法包括哪些？n何谓盐析？其原理是什么？何谓盐析？其原理是什么？n常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？n有机溶剂沉淀法的原理是什么？有机溶剂沉淀法的原理是什么？n影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？n等电点沉淀的原理是什么？等电点沉淀的原理是什么？通过本章学习应掌握以下内容通过本章学习应掌握以下内容1、沉淀：、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度利用沉析剂使

2、生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。降低而形成无定形固体沉淀的过程。2、沉淀法的目的：、沉淀法的目的：(通过沉淀达到通过沉淀达到浓缩浓缩的目的；的目的；(沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，分，初步纯化初步纯化 ；(将已纯化的产品由将已纯化的产品由液态变成固态液态变成固态，加以保存或进一，加以保存或进一步处理。步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。仍广泛应用在工业上和实验室中。一、概述(生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这

3、些条件就生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。会破坏溶液的稳定性。(沉淀法基本原理沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，控制溶液中各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。溶解度不同而达到分离的目的。(溶剂组分的改变、改变溶液的溶剂组分的改变、改变溶液的pHpH值、离子强度和极性都会值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。使溶

4、质的溶解度产生明显的改变。3 3、沉淀法的原理、沉淀法的原理n沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：通常按三步进行：4 4、沉淀法的操作、沉

5、淀法的操作 首先加入沉淀剂首先加入沉淀剂; ; 沉淀剂的沉化，促进粒子生长；沉淀剂的沉化，促进粒子生长； 离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响收率和沉淀物的形状都有很大影响。5 5、沉淀法的步骤、沉淀法的步骤沉淀法不仅可以用于实验室中；沉淀法不仅可以用于实验室中；也可广泛用于生产的制备过程。也可广泛用于生产的制备过程。因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常

6、用的方法。法。6 6、沉淀法的应用、沉淀法的应用7 7、沉淀法的优缺点、沉淀法的优缺点根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1 1）盐析法；）盐析法；（2 2）等电点沉淀法；）等电点沉淀法；（3 3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法；（4 4）亲和沉淀法；）亲和沉淀法；（5 5）选择性沉淀法。）选择性沉淀法。（6 6）复合盐沉淀法；）复合盐沉淀法；（7 7）非离子型聚合物沉淀法；）非离子型聚合物沉淀法；（8 8）聚电解质沉淀法；）聚电解质沉淀法；8 8、沉淀法的分类、沉淀法的分类二、蛋白质的溶解特性二、蛋白质的溶解特性n蛋白质是由疏水性各不相同的

7、蛋白质是由疏水性各不相同的 20 20 种氨基酸组成的种氨基酸组成的两性高分子电解质，形成两性高分子电解质，形成荷电区荷电区。n在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，形成向内部折叠的趋势，形成疏水区疏水区。疏水性氨基酸。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。n亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面，形成面，形成亲水区亲水区。n因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电荷电区区、亲水区亲水区和和疏水区疏

8、水区。蛋白质的溶解行为蛋白质的溶解行为n蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。分子周围溶液性质所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，其蛋白质在自然环境中通常是可溶的，其外部大部分是亲水的，内部大部分是疏外部大部分是亲水的，内部大部分是疏水的。水的。n一般而言，小分子蛋白质比在类似的大一般而言，小分子蛋白质比在类似的大分子蛋白质更易溶解。分子蛋白质更易溶解。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障u 蛋白质周围的水化层。蛋白质周围的水化层。保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋使蛋白质形成稳定的胶

9、体溶液。白质形成稳定的胶体溶液。u 蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用用（存在双电层）。（存在双电层）。蛋白质粒子在水溶液中蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。与溶液中反离子的电荷构成双电层。三、盐析三、盐析1 1、定义、定义盐析是可逆的，而变性是不可逆的盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在早在18591859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋白质，随后又在

10、尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。中使用，得到了比较满意的结果。 2 2、盐析法机理、盐析法机理（1 1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2 2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水由于憎水区域间作用使蛋白质聚

11、集而沉淀，憎水区域越多，越区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和电荷，减少静电斥力，）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。而沉淀。在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。

12、用较强，半径大的低价离子作用较弱。阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u（1 1） 价廉价廉 ；u（2 2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐

13、析出来；u（3 3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；u（4 4） 不易引起蛋白质变性。不易引起蛋白质变性。 6、盐析操作(加盐方式）硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶

14、液体积不大用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。u一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。一般

15、说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。u在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。度顺次进行。u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分再逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。盐析出来。 u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。7 7、盐浓度对盐析效果的影响、盐浓度对盐析效果的影响 S=- S=

16、-s sS S蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，g/L; g/L; I I离子强度离子强度I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 ,m ,mi i离子离子 i i的摩尔浓度；的摩尔浓度；ZiZi所带电荷所带电荷常数，常数，与温度、与温度、pHpH和蛋白质种类有关，与盐的种类无和蛋白质种类有关，与盐的种类无关；关；KsKs盐析常数，盐析常数，与温度和与温度和pHpH无关，但与蛋白质和盐的种类无关，但与蛋白质和盐的种类有关。有关。蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系CohnCohn经验式经验式n有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，

17、则上式成为则上式成为（用浓度代替离子强度）n式中式中m m为盐的摩尔浓度为盐的摩尔浓度. .8 8、用盐析法分离蛋白质的二种方法、用盐析法分离蛋白质的二种方法盐析法分为两类，盐析法分为两类，第一类叫第一类叫分段盐析法，分段盐析法，在一定离子强度下通过改在一定离子强度下通过改变变pHpH和温度来实现，（固定离子强度，和温度来实现，（固定离子强度，改变改变pHpH及及温度温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶；和结晶；第二种叫第二种叫KsKs分段盐析法，分段盐析法，在

18、一定在一定pHpH和温度下通过改和温度下通过改变离子强度实现，变离子强度实现，（固定固定pH, pH, 温度，温度，改变盐浓改变盐浓度度），），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。用于早期的粗提液。l由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子强度也不相同。所需的离子强度也不相同。l改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。分批盐析分开。分段盐析原理分段盐析原理n分段盐析的条件先需要进行分段盐析的条件先需要进行小实验探索小实验探索。

19、 先进行先进行0%-30%0%-30%的硫酸铵沉淀，再进行的硫酸铵沉淀，再进行30%-60%30%-60%的硫酸铵的硫酸铵沉淀，最后进行沉淀，最后进行60%-80%60%-80%的硫酸铵沉淀。的硫酸铵沉淀。 n每一段盐析静置之后都要离心获得沉淀，每一段盐析静置之后都要离心获得沉淀，透析并检测活透析并检测活性性。 比如实验中的活性物质主要在比如实验中的活性物质主要在60%-80%60%-80%盐析出来，在以后盐析出来，在以后的实验中，就可以首先进行的实验中，就可以首先进行0%-60%0%-60%的硫酸铵沉淀，这段的硫酸铵沉淀，这段沉淀物可以抛弃沉淀物可以抛弃（去除大多数杂质）；然后进行（去除大多

20、数杂质）；然后进行60%-60%-80%80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物含有的硫酸铵沉淀，这段沉淀物含有大量目的蛋白质大量目的蛋白质，将，将其收集进行下一步纯化工作。其收集进行下一步纯化工作。分分段段盐盐析析步步骤骤9 9、盐析用盐量的确定、盐析用盐量的确定-饱和度饱和度u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%85%饱和度时，溶解度饱和度时，溶解度都小于都小于 0.l mg0.l mgL L，通常为兼顾收率与纯度，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的

21、操作范围在饱和度的操作范围在40%-80%40%-80%之间。之间。调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表10、盐析的影响因素1）pH值u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。度最小。u为提高盐析效率，多将溶液为提高盐析效率，多将溶液pHpH值调到目的蛋白的值调到目的蛋白的等电点处。等电点处。 u注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整度下所测的结果是不同的，

22、需根据实际情况调整溶液溶液pHpH值，以达到最好的盐析效果。值，以达到最好的盐析效果。pH值PH两种蛋白质的相对溶解两种蛋白质的相对溶解度会随度会随pHpH而变化很大；而变化很大； 等电点附近有极小值等电点附近有极小值pH在进行盐折时，必在进行盐折时，必须控制须控制pHpH图中直线都相互平图中直线都相互平行行KsKspH值2 2）温度的影响）温度的影响u在低离子强度或纯水中，蛋白在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。增加而增加。u但在高盐浓度下，蛋白质、酶但在高盐浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降

23、。上升而下降。u在一般情况下，蛋白质对盐析在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4进行。进行。u随温度升高减小随温度升高减小uKsKs不随温度而变不随温度而变3 3）蛋白质浓度）蛋白质浓度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。有关。Z高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。发生严重共沉淀作用，除杂

24、蛋白的效果会明显下降。Z在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。用比较少，但回收率会降低。Z因此需要在两者之间进行适当选择。因此需要在两者之间进行适当选择。Z分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。Z一般认为一般认为2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于的蛋白质浓度比较适中。相当于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/mL。u对起始浓度

25、为对起始浓度为 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，大部分蛋白质在硫溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为酸铵饱和度为 58-6558-65之间沉淀出来；之间沉淀出来；u但对稀释但对稀释1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，饱和度达到溶液，饱和度达到66%66%时才开始时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%66-73%饱和度。饱和度。11 11、盐析注意事项、盐析注意事项(选择适宜饱和度选择适宜饱和度(采用分步盐析采用分步盐析(盐析的成败决定于溶液的盐析的成败决定于溶液的pHpH值与离子强度，稳定值与离子强度，稳定pH pH 用磷酸用磷酸缓冲液缓冲液(在加

26、入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。(盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。(为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。(盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以

27、免变性，透析较慢，一般可用超滤一般可用超滤盐析注意事项盐析注意事项硫酸铵的使用硫酸铵的使用硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用敏感作用，使用前用H H2 2S S处理处理高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0pH=5.0左右），使左右），使用前也需要用氨水调节至所需用前也需要用氨水调节至所需pHpH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸铵加入后体积变大固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；已考虑在表中；盐析后

28、一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。低浓度硫酸铵溶液。1212、盐析法特点、盐析法特点n成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。n操作简单、安全。操作简单、安全。n不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，

29、能得到保持生物活性的纯化蛋白质。到保持生物活性的纯化蛋白质。1.分离效果不理想，通常只是作为初步的分离分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。纯化，还需要结合其它的纯化方法。 四、等电点沉淀法等电点沉淀法 isoelectric point precipitation1 1、定义和原理、定义和原理在低的离子强度下，调在低的离子强度下，调pHpH至至等电点，使蛋白质净电荷为等电点，使蛋白质净电荷为零，降低了静电斥力，而疏零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。形成沉淀。不同的两性电解质具有不同不同的两性电解质具有不同的等电点

30、，以此为基础可进的等电点，以此为基础可进行分离。行分离。生产胰岛素（生产胰岛素（pI5.4pI5.4）时，）时，在粗提液中先调在粗提液中先调pH8.0pH8.0去除去除碱性蛋白质，再调碱性蛋白质，再调pH3.0pH3.0去去除酸性蛋白质。除酸性蛋白质。pH=pI大豆蛋白的溶解度随大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况的变化情况2 2、等电点沉淀法注意事项、等电点沉淀法注意事项F本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成较大的凝聚物。点时能形成较大的凝聚物。F但对一些亲水性强的蛋白质。则在低离子强度的溶液但对一些亲水性强的蛋白质。则在低离子强

31、度的溶液中，调中，调pHpH在等电点并不产生沉淀。在等电点并不产生沉淀。F在调节等电点时，如果采用强酸强碱，要注意防止酶在调节等电点时，如果采用强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使的失活或蛋白变性。为了使pHpH缓慢变动，也可用乙酸缓慢变动，也可用乙酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。等弱酸和碳酸钠等弱碱。F中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。低溶解度会有所增大。五、有机溶剂沉淀法五、有机溶剂沉淀法organic solvent precipitationorganic solvent precipitationl概念：

32、在含有溶质的水溶液中加入一定概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。使其沉淀析出。l有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。用，是较早使用的沉淀方法之一。1 1、有机溶剂沉淀法定义、有机溶剂沉淀法定义2 2、有机溶剂沉淀法机理、有机溶剂沉淀法机理*A 降低溶剂介电常数（介电常数降低溶剂介电常数（介电常数D有机有机 D水）水） 减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间作减小溶剂的极

33、性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间作用力，增加了蛋白质等带电粒子相互吸引力，聚合沉淀。用力，增加了蛋白质等带电粒子相互吸引力，聚合沉淀。*B 破坏水化膜：破坏水化膜： 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，使蛋白质沉淀。使蛋白质沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层结合形成疏水层3 3、常用的有机溶剂、常用的有机溶剂选择依据：选择依据：(水溶性要好水溶性要好(介电常

34、数要小介电常数要小(致变性作用要小致变性作用要小(毒性要小毒性要小(容易获取，成本低容易获取，成本低沉淀蛋白质常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀蛋白质常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸常用的是乙醇。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸常用的是乙醇。(乙醇：乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，沉析作用强，挥发性适中，无毒， 是最常用的有机沉淀剂；是最常用的有机沉淀剂；(丙酮丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广。范围不广。1 1、温度、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行u有机溶剂与水混合时

35、，会放出大量的热量，使溶液的温度显有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓著升高，增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。缓加入，防止溶液局部升温。u温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。沉淀越完全。 因此，有机溶剂须预先冷却到因此，有机溶剂须预先冷却到-10-10-20-20；在使用有机溶剂；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。4 4、有机溶剂沉淀法

36、的影响因素、有机溶剂沉淀法的影响因素 2 2、pHpH值：值： pHpH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3 3、样品浓度：、样品浓度：样品较稀将增加有机溶剂投入量和样品较稀将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。蛋白质的初浓度损耗；样品太浓会增加共沉作用。蛋白质的初浓度以以0.50.52 2为好，粘多糖则以为好，粘多糖则以1 12 2较合适。较合适。4 4、中性盐浓度：、中性盐浓度：较低浓度中性盐有利于沉淀作用，较低浓度中性盐有利于沉淀作用，减少蛋白质变性减少蛋白质变性, ,以以0.010.010.05M0.05M为好，常用为醋酸为好，常用为醋酸钠

37、钠/ /铵、氯化钠等。铵、氯化钠等。 5 5、某些金属离子：、某些金属离子：一些金属离子如一些金属离子如CaCa2+2+、ZnZn2+2+等可等可与蛋白质形成复合物，溶解度降低而不影响生物活与蛋白质形成复合物，溶解度降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成。性，有利于沉淀形成。优点：优点：l分辨能力比盐析法高，即某一种蛋白质只在一个比较窄的分辨能力比盐析法高，即某一种蛋白质只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；有机溶剂浓度下沉淀；l沉淀不用脱盐，过滤较为容易；沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点：缺点：u对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，u操作要求在低温下进

38、行。操作要求在低温下进行。u成本高成本高总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。5 5、有机溶剂沉淀法的特点、有机溶剂沉淀法的特点 举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取淀粉酶的提取-淀粉酶（米曲霉）发酵固体淀粉酶（米曲霉）发酵固体 + 水水 过滤过滤 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影响影响 收率收率% 酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6. pH * 适宜的适宜的pH 5.6 6.0 * 温度影响温度影响 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 适

39、宜的温度适宜的温度10 20 六、六、 亲和沉淀亲和沉淀u亲和沉淀是沉淀分离的一种，亲和沉淀是沉淀分离的一种，将亲和反应的高将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量有机结合量有机结合形成了亲和沉淀技术。形成了亲和沉淀技术。u定义：定义：利用蛋白质与特定的配基（免疫配体、利用蛋白质与特定的配基（免疫配体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。计出来的一种特殊选择性的分离技术。u其沉淀原理其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同：与通常的沉淀方法有很大的不同：不是依据蛋

40、白质溶解度差异，而是依据不是依据蛋白质溶解度差异，而是依据“吸附吸附” 蛋白质的特殊聚合物溶解度的大小。蛋白质的特殊聚合物溶解度的大小。1 1、定义和原理、定义和原理2 2、亲、亲 和和 沉沉 淀过程淀过程 n配基与载体的选择配基与载体的选择n将配基与可逆溶解载体偶联后形成载体将配基与可逆溶解载体偶联后形成载体- -配基复合物，配基复合物，n将目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配基络合将目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配基络合形成复合体；形成复合体；n改变溶液条件，使复合体沉淀析出；改变溶液条件，使复合体沉淀析出；n所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可所得沉淀物用一种适当的缓冲

41、溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；能存在的杂质；n用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。举例：胰蛋白酶的亲和沉淀举例：胰蛋白酶的亲和沉淀n配基（大豆胰蛋白酶抑制剂）固定于载体配基（大豆胰蛋白酶抑制剂）固定于载体（聚合脂质体（聚合脂质体- -醇磷脂乙醇胺）醇磷脂乙醇胺）n胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液进行胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液进行吸附；吸附；n加入加入0.2MNaCl0.2MNaCl使复合体沉淀使复合体沉淀n0.01 M NaOH0.01 M NaOH洗脱沉淀，释放胰蛋白酶洗脱沉淀，释放胰蛋白酶七、选择性变性沉淀法七、选择

42、性变性沉淀法n概念：概念：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。n原理：原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。n方法：方法：）利用对热的不稳定性）利用对热的不稳定性, ,加热破坏某加热破坏某些组分，而保存另一些组分；）酸碱变性。些组分，而保存另一些组分；）酸碱变性。 ）利用表面活性剂）利用表面活性剂( (

43、三氯乙酸三氯乙酸) )或有机溶剂引或有机溶剂引起变性；起变性；1 1、定义、原理和方法、定义、原理和方法选择性变性沉淀法是使选择性变性沉淀法是使杂质杂质变性沉淀，又对目的变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。学性质等有比较全面的了解。例如对于例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，可淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。受热变性沉淀而被除去。2 2、选择性变性沉淀法、选择性变性沉淀法u在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇，振荡一段时间、使蛋白戊醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿质在氯仿- -水的界面上形成沉淀