第十章 色谱技术

1、第十章第十章 色谱技术色谱技术目目 录录 第一节第一节 色谱技术概述色谱技术概述 第二节第二节 吸附色谱吸附色谱 第三节第三节 基于疏水作用的高效液相色谱基于疏水作用的高效液相色谱 第四节第四节 体积排阻色谱体积排阻色谱 第五节第五节 亲和色谱亲和色谱 第六节第六节 离子交换色谱离子交换色谱色谱基本理论、基本概念；生物药品的常色谱基本理论、基本概念；生物药品的常用吸附色谱、反相色谱、离子交换色谱以用吸附色谱、反相色谱、离子交换色谱以及亲和色谱技术及亲和色谱技术各种色谱技术中常用的色谱固定相各种色谱技术中常用的色谱固定相各类色谱技术的应用领域各类色谱技术的应用领域针对目标药物体系，熟练选择合适的

2、色针对目标药物体系，熟练选择合适的色谱技术对目标药物进行分离纯化。谱技术对目标药物进行分离纯化。 学习目标学习目标第一节第一节 色谱技术概述色谱技术概述 色谱(Chromatography)技术又被称为层析技术。一、色谱法分类一、色谱法分类固定相基质的形式固定相基质的形式分离原理分离原理 流动相的形式流动相的形式 纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱柱色谱柱色谱吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱体积排阻色谱体积排阻色谱离子交换色谱离子交换色谱亲和色谱亲和色谱 气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱超临界流体色谱超临界流体色谱 （一）概述（一）概述 液相色谱主要通过目标组分或待分离物在两液相色谱主要通过目标组分

3、或待分离物在两相间分配能力或作用力不同而使目标组分得以分相间分配能力或作用力不同而使目标组分得以分离，其中一相保持不动，称为固定相，而另一相离，其中一相保持不动，称为固定相，而另一相移动，被称为流动相。待分离组分，通过在固定移动，被称为流动相。待分离组分，通过在固定相以及流动相之间各种作用力的矢量和差异而得相以及流动相之间各种作用力的矢量和差异而得到分离，这些作用有色散力、氢键、离子键、亲到分离，这些作用有色散力、氢键、离子键、亲水作用、疏水作用、静电相互作用、分子扩散、水作用、疏水作用、静电相互作用、分子扩散、亲和、络合、共价键修饰或交换等。亲和、络合、共价键修饰或交换等。二、基本概念二、基

4、本概念加样和流动相入口加样和流动相入口洗脱液洗脱液收集并检测收集并检测进样进样阀阀检测器检测器输液输液泵泵贮液贮液瓶瓶进进样样流出液流出液色谱柱色谱柱 （二）固定相（二）固定相 也称为柱填料，是液相色谱的核心部件也称为柱填料，是液相色谱的核心部件。固定相的骨架材料又称为色谱基质利用化。固定相的骨架材料又称为色谱基质利用化学或其他方法将相应特性的分子键合至色谱学或其他方法将相应特性的分子键合至色谱基质表面，构成键合固定相，也称为键合相基质表面，构成键合固定相，也称为键合相色谱填料。色谱填料。 多孔硅胶多孔硅胶 可控孔径玻璃可控孔径玻璃 羟基磷灰石羟基磷灰石 氧化铝、氧化锆氧化铝、氧化锆无机材料无

5、机材料有机高分子有机高分子1.1.色谱基质色谱基质 聚苯乙烯聚苯乙烯-二乙烯苯二乙烯苯 聚甲基丙烯酸酯聚甲基丙烯酸酯 纤维素纤维素葡聚糖及其修饰产物葡聚糖及其修饰产物 2. .粒径和结构粒径和结构LCLC应用应用粒径（粒径（ m m ）分析型分析型3 31010制备型制备型10104040低压低压/ /大规模制备大规模制备型型4040150150极大规模制备型极大规模制备型150150300300中孔填料中孔填料大孔填料大孔填料微孔填料微孔填料 3. .填料孔径填料孔径 色谱基质的孔径一般必须是待纯化的溶质色谱基质的孔径一般必须是待纯化的溶质分子大小的分子大小的5倍以有利于它们通过分子扩散倍以

6、有利于它们通过分子扩散进入所有的孔。进入所有的孔。1000到到1000018050060120 4. .键合相：是键合相：是共价键合或通过吸附、涂敷等共价键合或通过吸附、涂敷等附着于色谱基质表面上的提供与流动相中溶质附着于色谱基质表面上的提供与流动相中溶质分子产生相互作用的分子。分子产生相互作用的分子。 三、色谱效率三、色谱效率（一）基本保留原理（一）基本保留原理信信号号强强度度tRBtRA半峰宽半峰宽WAh/2WBh/2WAWB基 线 峰基 线 峰宽宽to峰高峰高（h）AB0（样品注射（样品注射点）点）VoVRAVRB（死体积）（死体积）洗 脱 体 积洗 脱 体 积 /时间时间 保留因子或容

7、量因子：保留因子或容量因子：k =(tR-to)/to=(VR-Vo)/Vo k 越大，则表明该溶质在特定条件下与固定相越大，则表明该溶质在特定条件下与固定相的作用力越强，对应于保留时间来说，其保的作用力越强，对应于保留时间来说，其保留时间较长；反之，则保留时间较短。留时间较长；反之，则保留时间较短。 选择因子：选择因子： =kB /kA 选择因子选择因子 越大，则表明越大，则表明A和和B两种成分于特两种成分于特定条件下在该柱子上越容易被分离开来。定条件下在该柱子上越容易被分离开来。 柱效：柱效：N=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 柱子效率越高表明特定条件下固定相对某溶质的分

8、柱子效率越高表明特定条件下固定相对某溶质的分离效果越好。离效果越好。 分辨率：分辨率：Rs=(tRB-tRA)/(WA+WB)1/2 =(tRB-tRA)( WAh/2+WBh/2)0.85 =(1/4)( -1)(N1/2)(k /1+k ) Rs 值越大，两种组分分离的越好。值越大，两种组分分离的越好。 Rs = 1，两组，两组分具有较好的分离，互相沾染约分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的，即每种组分的纯度约为纯度约为98%。当。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到，每种组分的纯度可达到99.8%。ab峰 不 对 称 因 子峰 不 对

9、 称 因 子=b/a10%峰高峰高信信号号强强度度洗 脱 体 积洗 脱 体 积 /时间时间 峰不对称因子（峰不对称因子（As），主要是反映固定相与组分之间的作用），主要是反映固定相与组分之间的作用力强弱情况，如果力强弱情况，如果As越大，则表明组分与固定相在特定洗脱条越大，则表明组分与固定相在特定洗脱条件下相互作用力越大，产生拖尾现象。件下相互作用力越大，产生拖尾现象。（二）柱效（二）柱效 柱效：柱效：N=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 依据塔板理论，塔板数越高，表明溶质分子依据塔板理论，塔板数越高，表明溶质分子在柱子上的分离效率越高。在柱子上的分离效率越高。N已知，柱效可已

10、知，柱效可通过柱子的长度（通过柱子的长度（L）与理论塔板高度（）与理论塔板高度（H）之间的比值进行计算，即之间的比值进行计算，即N=L/H。 小粒径色谱填料、低流动相流速和不太粘稠小粒径色谱填料、低流动相流速和不太粘稠的流动相有利于减小的流动相有利于减小H值。值。H值小，则值小，则N大，大，此时此时W也小。也小。（三）样品负载量（三）样品负载量 样品负载量也称柱容量，是指可以注入色谱系统而又不会使样品负载量也称柱容量，是指可以注入色谱系统而又不会使柱过载的最大可进样品量，通常以每克柱填料对应的的最大柱过载的最大可进样品量，通常以每克柱填料对应的的最大进样量来表示。进样量来表示。 它显示了柱的大

11、小和其对应的样品处理能力，对于分析性色它显示了柱的大小和其对应的样品处理能力，对于分析性色谱来说，样品负载量决定了动态的分析范围。谱来说，样品负载量决定了动态的分析范围。 两种计算方法：两种计算方法： （1）以非装柱的形式，通过样品与对应数量的柱填料之间）以非装柱的形式，通过样品与对应数量的柱填料之间的平衡，确定最大样品负载量；的平衡，确定最大样品负载量； （2）以装柱的形式，在柱色谱中，当进样量达到柱子的饱）以装柱的形式，在柱色谱中，当进样量达到柱子的饱和负载量时，洗脱液中样品的浓度等于注入样品的浓度。和负载量时，洗脱液中样品的浓度等于注入样品的浓度。第二节第二节 吸附色谱吸附色谱 吸附是利

12、用吸附剂对液体或气体中某一组分吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程，被吸附的物质称为吸附质。面的过程，被吸附的物质称为吸附质。 四个步骤：四个步骤： （1）吸附剂通入待分离的料液（或气体）；）吸附剂通入待分离的料液（或气体）； （2）吸附质被吸附到吸附剂表面）吸附质被吸附到吸附剂表面 （3）料液流出）料液流出 （4）吸附质解吸回收，吸附剂再生。）吸附质解吸回收，吸附剂再生。一、吸附类型一、吸附类型（一）物理吸附（一）物理吸附分子间引力（范德华力）分子间引力（范德华力）特点：特点：（1）无选择性）无选择性（2）

13、吸附量可由物系不同）吸附量可由物系不同 相差较大相差较大（3）低温可进行）低温可进行（4）单、多分子层吸附均可）单、多分子层吸附均可（5）易达到吸附平衡状态）易达到吸附平衡状态 一、吸附类型一、吸附类型（二）化学吸附（二）化学吸附化学键化学键特点：特点：（1）较高温进行）较高温进行 （2）放热）放热 （3）单分子吸附）单分子吸附 （4）不易和解析，平衡慢）不易和解析，平衡慢 （5）选择性强）选择性强 一、吸附类型一、吸附类型（三）交换吸附（三）交换吸附双电层双电层特点：特点：（1）吸附剂和溶液发生离子交换）吸附剂和溶液发生离子交换 （2）吸附力决定于离子所带电荷）吸附力决定于离子所带电荷二、常

14、用吸附剂二、常用吸附剂 吸附剂具备特性：吸附剂具备特性：（1）对被分离的物质具有很强的吸附能力，即）对被分离的物质具有很强的吸附能力，即平衡吸附量大；平衡吸附量大；（2）有较高的吸附选择性；）有较高的吸附选择性；（3）有一定的机械强度，再生容易；）有一定的机械强度，再生容易；（4）性能稳定、价廉易得。）性能稳定、价廉易得。（一）、活性炭（一）、活性炭 活性炭按照粒径大小可分为粉末活性炭活性炭按照粒径大小可分为粉末活性炭、颗粒活性炭以及基于粉末活性炭制备的颗、颗粒活性炭以及基于粉末活性炭制备的颗粒型活性炭。粒型活性炭。 （二）、大孔网状聚合物吸附剂（二）、大孔网状聚合物吸附剂 性质与活性炭、硅胶

15、相似，简称大网格吸附剂性质与活性炭、硅胶相似，简称大网格吸附剂、大孔树脂吸附剂或吸附树脂。、大孔树脂吸附剂或吸附树脂。 （1）脱色去臭力与活性炭相当，对有机物质具有良）脱色去臭力与活性炭相当，对有机物质具有良好的选择性好的选择性 （2）性质稳定，机械强度好，经久耐用，品种多）性质稳定，机械强度好，经久耐用，品种多 （3）吸附速度快，易解吸，易再生，直径在）吸附速度快，易解吸，易再生，直径在0.20.8mm之间，不污染环境，使用方便之间，不污染环境，使用方便 （4）价格昂贵，吸附效果）价格昂贵，吸附效果 易受流速和溶质浓度等因易受流速和溶质浓度等因 素影响素影响1. 1. 大孔网状聚合物吸附剂类

16、型和结构大孔网状聚合物吸附剂类型和结构名称名称树脂结构树脂结构极性极性比表面比表面孔径孔径孔度孔度骨架密度骨架密度 交联剂交联剂XAD-1苯乙烯苯乙烯非极性非极性100200371.07二乙烯苯二乙烯苯XAD-233090421.07XAD-35264438XAD-475050511.08XAD-54156843XAD-6 丙烯酸酯丙烯酸酯中极性中极性6349849双双 -甲基甲基丙烯酸丙烯酸二乙醇二乙醇酯酯XAD-7 -甲基丙烯酸甲基丙烯酸酯酯45080551.24XAD-8 -甲基丙烯酸甲基丙烯酸酯酯140250521.25XAD-9 亚砜亚砜极性极性 25080451.26XAD-10丙

17、烯酰胺丙烯酰胺极性极性 69352XAD-11 氧化氮类氧化氮类强极性强极性170210411.18XAD-12氧化氮类氧化氮类强极性强极性251300451.172. 2. 大孔网状聚合物吸附剂吸附机制大孔网状聚合物吸附剂吸附机制大孔网状聚合物吸附能力与树脂的化学结构、物理大孔网状聚合物吸附能力与树脂的化学结构、物理性能、溶质及溶液的性质有关。性能、溶质及溶液的性质有关。非极性吸附剂非极性吸附剂适宜于从适宜于从极性溶剂极性溶剂（如水）中吸附（如水）中吸附非非极性物质极性物质。高极性吸附剂高极性吸附剂适宜于从适宜于从非极性溶剂非极性溶剂中吸附中吸附极性物质极性物质。中等极性的吸附剂两种者均可吸

18、附，在非极性溶剂中等极性的吸附剂两种者均可吸附，在非极性溶剂中吸附时，溶质分子以亲水性部分吸着在吸附剂上中吸附时，溶质分子以亲水性部分吸着在吸附剂上，而当它在极性溶媒中可同时吸附溶质分子的极性，而当它在极性溶媒中可同时吸附溶质分子的极性和非极性部分。和非极性部分。解析方法解析方法3241 1低级醇、酮或其水溶液低级醇、酮或其水溶液 碱解析弱酸性溶质碱解析弱酸性溶质酸解析弱碱性溶质酸解析弱碱性溶质水洗水洗其他因素：无机盐、孔径其他因素：无机盐、孔径比表比表面积面积极极 性性颗粒度颗粒度孔径孔径吸附容量大、吸附速度快、机械强度好吸附容量大、吸附速度快、机械强度好 三、影响吸附的因素三、影响吸附的因

19、素（一）吸附剂的性质（一）吸附剂的性质固体表面张力越小，液体被吸附越多固体表面张力越小，液体被吸附越多溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较小吸附量较小同系列物质，吸附量的变化有规律同系列物质，吸附量的变化有规律 极性相似，相吸附极性相似，相吸附预测相对吸附量预测相对吸附量（二）吸附质的性质（二）吸附质的性质脱色和除热原一般用活性炭，去过敏物质常用白陶土脱色和除热原一般用活性炭，去过敏物质常用白陶土。 （三）温度（三）温度放热。一旦达到放热。一旦达到吸附平衡，吸附平衡，温度温度会使吸附量会使吸附量。但。但低温时，低温时， 温度温度吸附速度吸附速度吸附量吸附量吸

20、热。在这种情吸热。在这种情况下，况下， 温度温度吸吸附量附量考虑热稳定性。考虑热稳定性。酶热不稳定，酶热不稳定，0左右吸附；比较左右吸附；比较稳定，室温操作稳定，室温操作 普通普通吸附吸附蛋白质蛋白质吸附吸附生化物生化物质吸附质吸附影响吸附影响吸附的因素的因素盐的浓度盐的浓度溶液溶液pHpH吸附物吸附物浓度与浓度与吸附剂吸附剂用量用量实验确定实验确定 等电点附近等电点附近吸附量最大吸附量最大。有机酸在。有机酸在酸性下，胺酸性下，胺类在碱性下类在碱性下较易为非极较易为非极性吸附剂所性吸附剂所吸附。吸附。吸附质平衡吸附质平衡浓度愈大，浓度愈大，吸附量愈大吸附量愈大；蛋白质、；蛋白质、酶分离时，酶分

21、离时，浓度浓度1%，以增强选择以增强选择性；吸附剂性；吸附剂用量用量第三节第三节 基于疏水作用的高效液相色谱基于疏水作用的高效液相色谱 以疏水作用为基础的液相色谱分离技术主要是反相高效色谱（RP-HPLC）和疏水相互作用色谱（HIC）。一、反相高效液相色谱一、反相高效液相色谱 （一）概述（一）概述 RP-HPLC是指固定相具有疏水性功能是指固定相具有疏水性功能团构成的表面，在高效分离模式中，流动团构成的表面，在高效分离模式中，流动相的极性一般比固定相强，因此称之为反相的极性一般比固定相强，因此称之为反相高效液相色谱。相高效液相色谱。 应用：分析、分离、脱盐应用：分析、分离、脱盐 特点：高分辨率

22、、联用特点：高分辨率、联用 填料：修饰硅胶、高分子填料：修饰硅胶、高分子一、反相高效液相色谱一、反相高效液相色谱 （二）流动相的选择（二）流动相的选择 1.1.反相色谱：反相色谱：流动相极性大于固定相极性流动相极性大于固定相极性的色谱模式。的色谱模式。 常用流动相：甲醇、乙腈等常用流动相：甲醇、乙腈等0100%水溶水溶液。根据需要可使用液。根据需要可使用pH2pH8的缓冲液、的缓冲液、离子对试剂如离子对试剂如0.1%的三氟乙酸的三氟乙酸 流动相选择：相似相溶；流动相选择：相似相溶；溶质分子疏水性溶质分子疏水性强，增加有机相的比例，更换洗脱能力更强，增加有机相的比例，更换洗脱能力更强的洗脱剂。强

23、的洗脱剂。 洗脱能力强弱一般为四氢呋喃洗脱能力强弱一般为四氢呋喃乙腈乙腈甲醇甲醇 一、反相高效液相色谱一、反相高效液相色谱 （二）流动相的选择（二）流动相的选择 2.2.正相色谱正相色谱 固定相：未经修饰的硅胶、氧化铝、二氧化锆等固定相：未经修饰的硅胶、氧化铝、二氧化锆等，也可以是经过表面修饰后的色谱填料。，也可以是经过表面修饰后的色谱填料。 采用相对较强的洗脱剂。在正相色谱模式中，一采用相对较强的洗脱剂。在正相色谱模式中，一般般很少使用含水溶剂很少使用含水溶剂，在个别情况下，如以硅胶，在个别情况下，如以硅胶作为固定相时，水可以极微量的形式存在用于饱作为固定相时，水可以极微量的形式存在用于饱和

24、硅胶表面上的活性较强的硅羟基位点。和硅胶表面上的活性较强的硅羟基位点。 正相色谱流动相可以是石油醚、环己烷、苯、甲正相色谱流动相可以是石油醚、环己烷、苯、甲苯、乙醇等。苯、乙醇等。二、疏水相互作用色谱二、疏水相互作用色谱 HIC主要应用于蛋白质或多肽类的分离中。主要应用于蛋白质或多肽类的分离中。HIC是一种基是一种基于蛋白质和固定相非极性区域相互作用的分离过程，于蛋白质和固定相非极性区域相互作用的分离过程，HIC是是IEC（离子交换色谱）和（离子交换色谱）和SEC（体积排阻色谱）的补充（体积排阻色谱）的补充，联用，联用RP-HPLC可进行进一步分离纯化和脱盐。可进行进一步分离纯化和脱盐。 HI

25、C分离蛋白质通常是在中性条件下以线性递减的盐梯度分离蛋白质通常是在中性条件下以线性递减的盐梯度进行洗脱。起始缓冲的盐浓度典型的是在进行洗脱。起始缓冲的盐浓度典型的是在1.52.0 M硫酸硫酸铵，随着盐浓度的减小，吸附不强的蛋白质首先被洗脱下铵，随着盐浓度的减小，吸附不强的蛋白质首先被洗脱下来。来。 HIC可以保持蛋白质或多肽的生物活性而又可有效对其进可以保持蛋白质或多肽的生物活性而又可有效对其进行分离行分离 HIC所选用的基质材料通常为硅胶、聚甲基丙烯酸酯、琼所选用的基质材料通常为硅胶、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖以及其他相关高分子，粒径可以在脂糖以及其他相关高分子，粒径可以在5200 m范围内范围

26、内选择。选择。第四节第四节 体积排阻色谱体积排阻色谱 体积排阻色谱（体积排阻色谱（SEC）是将分子按照其大）是将分子按照其大小进行分离的色谱技术，根据固定相和使小进行分离的色谱技术，根据固定相和使用环境的不同主要有两种类型，凝胶过滤用环境的不同主要有两种类型，凝胶过滤色谱（色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（）和凝胶渗透色谱（GPC）。）。特点特点柱负载量可通过固定相的量来控制，利于制备分离。柱负载量可通过固定相的量来控制，利于制备分离。严格按分子流严格按分子流体力学体积进体力学体积进行分离行分离大分子可以测定其分子量和分子量分布大分子可以测定其分子量和分子量分布固定相惰性，无需梯度洗脱；柱寿命较长

27、；固定相惰性，无需梯度洗脱；柱寿命较长；固定相生物相容性好，生物大分子活性回收率高固定相生物相容性好，生物大分子活性回收率高分辨率较低，只适用于分子大小差别较大的体系，其峰容量也较低分辨率较低，只适用于分子大小差别较大的体系，其峰容量也较低 一、分离机制一、分离机制 SEC过程是利用固定相的孔径分布，使分过程是利用固定相的孔径分布，使分子按照其流体力学体积在固定相的孔及流子按照其流体力学体积在固定相的孔及流动相之间不断进行分配而最终分离的。溶动相之间不断进行分配而最终分离的。溶剂分子由于相对于固定相的孔径来说通常剂分子由于相对于固定相的孔径来说通常是非常小的，可以自由出入固定相内各种是非常小的

28、，可以自由出入固定相内各种孔径的孔，而溶质分子一般仅扩散至孔径孔径的孔，而溶质分子一般仅扩散至孔径比自己大的孔中，大于固定相最大可允许比自己大的孔中，大于固定相最大可允许进入其孔的大分子，一般只是在构成色谱进入其孔的大分子，一般只是在构成色谱柱的颗粒之间进行分配。柱的颗粒之间进行分配。二、凝胶过滤色谱二、凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱是在水相淋洗体系中，对于凝胶过滤色谱是在水相淋洗体系中，对于水溶性大分子化合物按其分子尺寸大小进水溶性大分子化合物按其分子尺寸大小进行分离的一种液相色谱技术。行分离的一种液相色谱技术。 应用：水溶性物质尤其是高分子量水溶性应用：水溶性物质尤其是高分子量水溶性化合物的分

29、离。在溶质分子量相差较大的化合物的分离。在溶质分子量相差较大的情况下，情况下，GFC方法是目前最简便的一种分方法是目前最简便的一种分离手段，离手段，GFC可用于初级分离、缓冲液交可用于初级分离、缓冲液交换、有机溶剂纯化，用于高分辨和高效快换、有机溶剂纯化，用于高分辨和高效快速分离以及分子量的测定等速分离以及分子量的测定等 （一）多糖型（一）多糖型GFC填料填料产品产品分离范围分离范围（球蛋白）（球蛋白）粒径粒径/ / m耐压耐压/MPa最高流最高流速速/ /cm/h应用特性应用特性Superdex 75 prep grade300070000 22440.390重组蛋白、细胞色素重组蛋白、细胞

30、色素Superose 6 prep grade5000510622400.440肽类蛋白、多糖、寡核苷肽类蛋白、多糖、寡核苷酸、病毒酸、病毒Sephacyl S-200 HR500025000025750.260白蛋白、血液抗体、单抗白蛋白、血液抗体、单抗Sephacyl S-1000 HR葡聚糖葡聚糖51051108401050.1300巨大多糖分子；小颗粒分巨大多糖分子；小颗粒分子如膜结合囊子如膜结合囊(7的溶液中才能正常工作，对的溶液中才能正常工作，对酸性更弱的酚羟基树脂，则应的酸性更弱的酚羟基树脂，则应的pH9的溶液中才能进的溶液中才能进行反应。行反应。 RCOO-Na+在水中不稳定，

31、遇水易水解成在水中不稳定，遇水易水解成RCOO-H+，同时产生同时产生NaOH，故钠型羧酸树脂不易洗涤到中性，一，故钠型羧酸树脂不易洗涤到中性，一般洗到般洗到pH=99.5即可，洗水量也不宜过多。即可，洗水量也不宜过多。 和强酸性阳离子交换性质相反，和强酸性阳离子交换性质相反，H+和弱酸阳离子树脂和弱酸阳离子树脂的结合力很强，故易再生成氢型，耗酸量亦少。的结合力很强，故易再生成氢型，耗酸量亦少。 3. 中强酸性阳离子交换树脂：酸度介于强酸性阳中强酸性阳离子交换树脂：酸度介于强酸性阳离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂中间，即离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂中间，即含磷酸基团含磷酸基团PO(OH

32、)2和次磷酸基团和次磷酸基团PHO(OH)的树脂。的树脂。（二）阴离子交换树脂（二）阴离子交换树脂 1. 强碱性阴离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂：活性基是季铵基团，有活性基是季铵基团，有三甲胺基团（三甲胺基团（I型）和二甲基型）和二甲基-羟基乙基胺基团（羟基乙基胺基团（II型）。活性基团电离程度较强，不受溶液型）。活性基团电离程度较强，不受溶液pH变化的变化的影响，在影响，在pH=114范围内均可使用。范围内均可使用。 成氯型时较羟型稳定、耐热性亦较好，因此，商品成氯型时较羟型稳定、耐热性亦较好，因此，商品大多以氯型出售。大多以氯型出售。I型树脂的热稳定性、抗氧化性、型树脂的热稳定性、抗氧化

33、性、机械强度、使用寿命均好于机械强度、使用寿命均好于II型树脂，但再生较难；型树脂，但再生较难；II型树脂抗有机污染好于型树脂抗有机污染好于I型，型，II型树脂碱性亦弱于型树脂碱性亦弱于I型型。由于。由于OH-和强碱交换树脂结合力较弱，再生剂和强碱交换树脂结合力较弱，再生剂NaOH用量较大。用量较大。 主要用于制备无盐水（除去主要用于制备无盐水（除去SiO2-、CO32-等弱酸根等弱酸根）及卡那霉素、巴龙霉素、新霉素等的精制。）及卡那霉素、巴龙霉素、新霉素等的精制。 2. 弱碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂 这类树脂的活性基团有伯胺、仲胺和叔胺这类树脂的活性基团有伯胺、仲胺和叔胺以及以及

34、吡啶等基团。基团的电离程度弱、和弱酸阳离子吡啶等基团。基团的电离程度弱、和弱酸阳离子树脂一样交换能力受溶液树脂一样交换能力受溶液pH的变化影响很大，的变化影响很大，pH越低，交换能力越高，反之则小，故在越低，交换能力越高，反之则小，故在pH7的溶液中使用。的溶液中使用。 羟基伯胺型树脂还可进一步与羟基伯胺型树脂还可进一步与CHO发生缩合反发生缩合反应：应： 和弱酸阳离子树脂相似，弱碱性阴离子交换树脂和弱酸阳离子树脂相似，弱碱性阴离子交换树脂生成的盐生成的盐RN+H3Cl-易水解成易水解成RN+H3OH-，这说明，这说明OH-结合力很强，故用结合力很强，故用NaOH再生成羟型较容易，再生成羟型较

35、容易，耗碱量亦少，甚至可用耗碱量亦少，甚至可用Na2CO3再生。再生。 3. 中强碱性阴离子交换树脂中强碱性阴离子交换树脂 中强碱性阴离子交换树脂则兼有以上两类活性基团。中强碱性阴离子交换树脂则兼有以上两类活性基团。类型类型性能性能阳离子交换树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂强酸性强酸性弱酸性弱酸性强碱性强碱性弱碱性弱碱性活性基团活性基团磺酸磺酸羧酸羧酸季胺季胺伯、仲、叔胺伯、仲、叔胺pHpH对交换能对交换能力的影响力的影响无无酸性溶液中交酸性溶液中交换能力很小换能力很小无无碱性溶液中交换碱性溶液中交换能力很小能力很小盐的稳定性盐的稳定性稳定稳定洗涤时水解洗涤时水解稳定稳定洗涤时水

36、解洗涤时水解再生再生3 35 5倍再倍再生剂生剂1.51.52 2倍再生剂倍再生剂3 35 5倍再生倍再生剂剂1.51.52 2倍再生剂可倍再生剂可用碳酸钠或氨用碳酸钠或氨水水交换速度交换速度快快慢（除非离子慢（除非离子化）化）快快慢（除非离子化慢（除非离子化） 离子交换树脂活性基团的解离程度强弱，离子交换树脂活性基团的解离程度强弱，即电离常数（即电离常数（pK）不同，决定了该树脂的）不同，决定了该树脂的强弱。因此，活性基团的强弱。因此，活性基团的pK值能直接表征值能直接表征树脂的强弱程度。对阳离子交换树脂来说树脂的强弱程度。对阳离子交换树脂来说，pK值愈小，酸性愈强，反之，对阴离子值愈小，酸

37、性愈强，反之，对阴离子交换树脂来说交换树脂来说pK值愈大，碱性愈强。值愈大，碱性愈强。（三）多糖基离子交换剂（三）多糖基离子交换剂 多糖基离子交换剂：离子交换纤维素、葡聚糖离多糖基离子交换剂：离子交换纤维素、葡聚糖离子交换剂两类。子交换剂两类。 1. 离子交换纤维素离子交换纤维素 离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对大分子的大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓实际交换容量大；吸附力弱

38、，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨力强，能分离复杂的生和，不易引起变性；分辨力强，能分离复杂的生物大分子混合物。物大分子混合物。 2. 葡聚糖凝胶离子交换剂葡聚糖凝胶离子交换剂 葡聚糖凝胶离子交换剂是将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶离子交换剂是将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。 这类离子交换剂具有离子交换和分子筛的双重作这类离子交换剂具有离子交换和分子筛的双重作用及对生物分子有很高的分辨率，多用于蛋白质用及对生物分子有很高的分辨率，多用于蛋白质、多肽类生化药物的分离。、多肽类生化药物的分离。 离子交换交联葡聚糖有很高的电荷密度，故比离离子交换交

39、联葡聚糖有很高的电荷密度，故比离子交换纤维素有更大的总交换容量，但当洗脱介子交换纤维素有更大的总交换容量，但当洗脱介质的质的pH值或离子强度变化时，会引起凝胶体积的值或离子强度变化时，会引起凝胶体积的较大变化，由此而影响流速。较大变化，由此而影响流速。三、离子交换操作方法三、离子交换操作方法 （一）树脂的选择（一）树脂的选择 分离原理：树脂与分离目的物和主要杂质吸附力的分离原理：树脂与分离目的物和主要杂质吸附力的差异差异 当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性弱碱性的树脂。这样有利于提高选择性，并便于洗弱碱性的树脂。这样有利于提高选择性，并便于

40、洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，往往选用强碱、强酸树脂。如氨基酸的分离多用强往往选用强碱、强酸树脂。如氨基酸的分离多用强酸树脂，以保证有足够的结合力，便地分步洗洗脱酸树脂，以保证有足够的结合力，便地分步洗洗脱，对于大多数蛋白质，酶和其他生物大分子的分离，对于大多数蛋白质，酶和其他生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。性，有利于洗脱，并提高选择性。 含苯酚的磺酸型树脂及胶型阴离子树脂不宜与强碱含苯酚的磺酸型树脂及胶型阴离子树脂不宜与强碱长时间接

41、触，尤其是在加热的情况下。长时间接触，尤其是在加热的情况下。（二）（二） 树脂的处理和再生树脂的处理和再生 1. 树脂的预处理树脂的预处理 物理处理：根据视觉观察是否需要粉碎、过筛及物理处理：根据视觉观察是否需要粉碎、过筛及去杂，一般仅需要水洗去杂（如木屑、泥沙）即去杂，一般仅需要水洗去杂（如木屑、泥沙）即可，再用酒精或其他溶剂浸泡以去除吸附的少量可，再用酒精或其他溶剂浸泡以去除吸附的少量有机物质。有机物质。 化学处理：用化学处理：用810倍量的倍量的1mol/L盐酸搅拌浸泡盐酸搅拌浸泡4h以上，然后用水反复洗至近中性；再以以上，然后用水反复洗至近中性；再以810倍倍体积的体积的1mol/L氢

42、氧化钠溶液搅拌浸泡氢氧化钠溶液搅拌浸泡4h以上，反以上，反复以水洗至近中性后再用复以水洗至近中性后再用810倍体积倍体积1mol/L盐酸盐酸浸泡，最后水洗至中性备用，其中最后一步用酸浸泡，最后水洗至中性备用，其中最后一步用酸处理使之变为氢型树脂操作也可称为转型。处理使之变为氢型树脂操作也可称为转型。 2. 树脂的再生、转型和毒化树脂的再生、转型和毒化 再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。过程。 再生方法：去杂，即用大量水冲洗，以去除树脂表再生方法：去杂，即用大量水冲洗，以去除树脂表面和孔隙内部物理吸附的各种杂质。然后再用酸、面和孔隙内部

43、物理吸附的各种杂质。然后再用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质，使其恢复原有碱处理除去与功能基团结合的杂质，使其恢复原有的静电吸附能力。的静电吸附能力。 转型，即树脂去杂后，为了发挥其交换性能，按照转型，即树脂去杂后，为了发挥其交换性能，按照使用要求赋予平衡离子的过程。对于弱酸性树脂须使用要求赋予平衡离子的过程。对于弱酸性树脂须用碱（用碱（NaOH）或酸（）或酸（HCl）转型。对于强酸或强碱）转型。对于强酸或强碱性树脂除使用碱、酸外还可以用相应的盐溶液转型性树脂除使用碱、酸外还可以用相应的盐溶液转型，在稳定性方面，碱性树脂不及酸性树脂，在处理，在稳定性方面，碱性树脂不及酸性树脂，在处理和再生过程中应加以注意。和再生过程中应加以注意。 毒化是指树脂失去交换性能后不能用一般的再生手毒化是指树脂失去交换性能后不能用一般的再生手段重获交换能力的现象。段重获交换能力的现象。 （三）（三） 基本操作方法基本操作方法 1. 离子交换操作的方式离子交换操作的方式 离子交换操作一般分为静态和动态操作两种。静离子交换操作一般分为静态和动态操作两种。静态交换是将树脂与交换溶液混合置一定的容器中