第八章 植物基因克隆原理与技术

1、第八章第八章 植物基因的克隆原理与技术植物基因的克隆原理与技术 内内 容容 一基因克隆所需要的酶和载体一基因克隆所需要的酶和载体 二植物转化载体的构建二植物转化载体的构建 三基因克隆的方法三基因克隆的方法基因克隆所需要的酶和载体基因克隆所需要的酶和载体一般认为基因工程诞生于1973年上世纪40年代70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。1- DNA是遗传物质被证实1944年，Avery O.T.肺炎双球菌转化实验2- DNA双螺旋模型的提出Watson 和和Crick 1953年，James Watson 和Francis Crick提

2、出了DNA的双螺旋模型。3 “中心法则”的提出以Nireberg等为代表的一批科学家确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。1 工具酶的发现和应用 Smith等分离并纯化了等分离并纯化了限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Hind II， 19721972年，年，BoyerBoyer等相继发现了等相继发现了coR I 一类重要的限制性内一类重要的限制性内切酶。切酶。 Werner Arber 1968年发现限制酶年发现限制酶1 工具酶的发现和应用 19671967年，世界上五个实验室几乎同时

3、发现年，世界上五个实验室几乎同时发现DNADNA连接酶连接酶，特别是特别是19701970年年KhoranaKhorana等发现的等发现的T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶具有更高的连具有更高的连接活性。接活性。2 反转录酶的发现和应用19701970年，年，BaltimoreBaltimore等和等和TeminTemin等各自发现了等各自发现了反转录酶反转录酶，完，完善了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。善了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。3 载体的发现和应用 19721972年，美国年，美国StanfordStanford大学的大学的P.BergP.Berg等首次成功地

4、实等首次成功地实现了现了DNADNA的体外重组。的体外重组。3 载体的发现和应用 19731973年，年，StanfordStanford大学的大学的CohenCohen等成功地利用体外重组等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。提取目的DNA酶切DNA片段导入到细菌中重组菌的筛选序列分析和基因表达等研究植物基因工程的基本流程载体基因克隆所需要的酶类 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶1 1、限制性核酸内切酶的发现、限制性核酸内切酶的发现2 2、限制性核酸内切酶的命名和分类、限制性

5、核酸内切酶的命名和分类3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内限制性内切酶将侵入细菌体内的外源的外源DNADNA切成小片断。切成小片断。修饰修饰（Modification）细菌自身的细菌自身的DNADNA碱基被碱基被甲基化甲基化酶酶甲基化修饰所保护，不能被甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。自身的限制性内切酶识别切割。限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶限制性核酸内切

6、酶（ Restriction endonucleases）：是一：是一类能够识别双链类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链精确特异地切割双链DNA分子的核酸分子的核酸内切酶内切酶。已经从近。已经从近300种种微生物微生物中分离出了中分离出了2300种，其中商品化的限制性核酸内切种，其中商品化的限制性核酸内切酶酶500余种。余种。限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母寄主菌属名的第一个字母和和种名的头两个字母种名的头两个字母组成组成3个斜个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称。体字母的略语表示酶来源的菌种名称。如：大肠杆菌如

7、：大肠杆菌Escherichia coli 表示为表示为Eco ；属名流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为表示为Hin；种名2、修饰性酶用、修饰性酶用M表示，限制性酶用表示，限制性酶用R表示表示 如如 R. Hin M. Eco3、用一个正体字母表示菌株的类型、用一个正体字母表示菌株的类型 如如Escherichia coli RY13 Eco R4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如如Eco R I、 Hin d III目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。lI 型限制性内切酶型限制

8、性内切酶lII 类限制性内切酶类限制性内切酶lIII类限制性内切酶类限制性内切酶限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析I 型II 型III 型限制-修饰活性单一多功能的酶限制酶和修饰酶分开双功能酶内切酶的蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基活性辅助因子ATP、Mg2+、SAMATP、Mg2+、SAMMg2+甲基化位点寄主特异性的位点特异性切割否是否基因克隆中的用途用途有限十分广泛用途有限II型限制性核酸内切酶的3大特点l识别位点的特异性 l识别序列的对称性 l切割位点的规范性与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端 ( cohesive ends

9、 )：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。5端凸出（如EcoR I）3端凸出（如Pst I）平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同裂酶同裂酶 (isoschizomers )(isoschizomers )：能识别和切割能识别和切割同样的核苷酸靶序同样的核苷酸靶序列列的不同内切酶。的不同内切酶。完全同裂酶完全同裂酶识别位点和切点完全相同识别位点和切点完全相同 如如Hind 和和Hsu I不完全同裂酶不完

10、全同裂酶识别位点相同但切点不同识别位点相同但切点不同如如Xma I 和和 Sma I同尾酶同尾酶(isocaudamers):(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能识别的靶序列不同，但能产生相同产生相同粘性末端粘性末端的一类限制性核酸内切酶。的一类限制性核酸内切酶。注注 意：意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。将不能被该两种酶的任一种所识别。BamH IG GATCCCCTAG GII 经同尾酶

11、消化的DNA末端连接示意图5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II影响酶活性的因素很多：影响

12、酶活性的因素很多：lDNADNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素 纯度的鉴定：紫外吸光值纯度的鉴定：紫外吸光值A260/A280A260/A280 浓度低于浓度低于500ng/500ng/ Ll酶切消化的缓冲液酶切消化的缓冲液 Mg2+ Tris-HCL BSA BSA（牛血清蛋白）（牛血清蛋白）l酶切反应的温度（通常为酶切反应的温度（通常为3737）l影响酶切消化的其他因素影响酶切消化的其他因素 时间时间 体积体积 RNARNA限制性核酸内切酶的消化反应酶切反应的基本步骤Buffer (10) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LE

13、nzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb0.4kb0.5kb0.6kb1.0kb电泳紫外分析37 1h加反应液CKMCKMTT1 1、DNADNA连接酶作用的机理连接酶作用的机理2 2、DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件3 3、DNADNA连接的策略连接的策略DNADNA连接酶及其应用连接酶及其应用DNA连接酶的发现连接酶的发现T4DNAT4DNA连接酶连接酶:由大肠杆菌由大肠杆菌T4T4噬菌体噬菌体DNADNA编码，以编码，以ATPATP作为能源辅作为能源辅助因子。助因子。 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNADNA

14、分子，所以分子，所以在基因克隆中应用广泛。在基因克隆中应用广泛。DNA连接酶连接酶:由大肠杆菌基因组由大肠杆菌基因组DNA编码，以编码，以NAD+作为能作为能源源辅助因子。辅助因子。 从细菌从细菌DNADNA环化现象推测，必定存在一种能把两条环化现象推测，必定存在一种能把两条DNADNA双双链连接到一起的酶。链连接到一起的酶。DNADNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A.A. 连接的两条链必须分别具有连接的两条链必须分别具有 33端自由羟基（端自由羟基（-OH-OH） 和和55端磷酸基团（端磷酸基团（-P-P），而且只有这两个基团彼此相邻时），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；才

15、能进行连接反应；B B. . 连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即即ATPATP和和NADNAD+ +。DNA连接反应的条件4 过夜加反应液转化CK-CK+重组菌影响连接效率的因素有：影响连接效率的因素有：l温度（最主要的因素）温度（最主要的因素）ldNTPdNTP的浓度的浓度(10(10 M-1M-1 M M) )l连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）l反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜）l插入片段和载体片段的摩尔比插入片段和载体片段的摩尔比平末端DNA片段的末端加尾连接法335

16、53355末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTTDNADNA聚合酶和聚合酶和T4DNAT4DNA连接酶连接酶平末端DNA片段加接头连接法 衔接物衔接物(linker)(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-1210-12个核苷个核苷酸的酸的DNADNA双链，其中包含有双链，其中包含有1 1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的接物和目的片段的55端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNAT4DNA连

17、接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNADNA片段。片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶聚合酶 T4 DNA聚合酶聚合酶Taq聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用DNADNA聚合酶聚合酶35

18、外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性聚合聚合速率速率持续能持续能力力大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低Klenow fragmentKlenow fragment低低无无中中低低T4DNAT4DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低T7DNAT7DNA聚合酶聚合酶高高无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶无无有有快快高高常用常用DNADNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较逆转录酶逆转录酶 一种可以有效地将一种可以有效地将mRNAmRNA转录成为转录成为DNADNA的酶，其产物称为的酶，其产物称为cDNA (complemen

19、tary DNA)。实际上，是一种实际上，是一种RNARNA依赖的依赖的DNADNA聚合酶。聚合酶。来源来源 RNARNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。 最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）和）和鼠白血病毒反转录酶鼠白血病毒反转录酶（avian myeloblastosis virus, M-MLV）AMVAMV的性质的性质 由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。聚合酶聚合酶活性和活性和 RNaseHRNaseH活性。活性。RNaseHRNaseH： 经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以经过

20、蛋白酶水解后产生的一条多肽。以53或或35方向特异地水解方向特异地水解RNA-DNARNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNARNA链。链。RNADNARNaseHRNADNA逆转录酶的用途逆转录酶的用途l合成合成cDNAcDNA以以oligo dToligo dT为引物（与为引物（与mRNAmRNA的的polyApolyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。lRT-PCRRT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNAmRNA反转录出反转录出cDNAcDNA第一链。第一链。mRNA 5A A A A A AT T T T T T 35mRNA 5A A A A A

21、AT T T T T T 35DNADNA修饰酶修饰酶l末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶lT4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶细菌性碱性磷酸酶细菌性碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase，BAP从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。小牛肠碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。SDSSDS中加热中加热6868可完全可完全失活。失活。碱性磷酸酶的特性：碱性磷酸酶的特性：催化脱掉催化脱掉DNADNA（或（或RNARNA）55端的

22、磷酸根。端的磷酸根。5 P-OH 35 HO-P35 HO-OH 35 HO-OH 3碱性磷酸酶Hind酶切 5AAGCTT TTCGAA 5 碱性磷酸酶A-OH5P-AGCTTTTCGA-P5HO-AA-OH5HO-AGCTTTTCGA-OH5HO-A易载体自连碱性磷酸酶的功能碱性磷酸酶的功能l防止线性化的载体份子自我连接防止线性化的载体份子自我连接A-OH5HO-AGCTTTTCGA-OH5HO-A外源DNA5P-AGCTTA-OH33HO-ATTCGA-P5连接酶A-AGCTTAAGCTTTTCGA-ATTCGAA转入细菌后会被修复基因工程载体基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到

23、扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。n分子较小，可携带比较大的分子较小，可携带比较大的DNA片段。片段。 n能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 n要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）。）。 n有适合的标记，易于选择。有适合的标记，易于选择。 n有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽有时还要求载体要能启动

24、外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。可能是高效的表达。 n从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等。验室内特殊菌种内才可复制等。 载体需要满足的条件载体需要满足的条件载体分类载体分类根据功能分：根据功能分：n克隆载体克隆载体: :克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断n表达载体表达载体: :用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达n整合载体整合载体: :把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中根据来源：根据来源： n质粒载体质粒载体n噬菌体载体噬菌体载体n柯斯质粒载体

25、柯斯质粒载体n人工染色体载体人工染色体载体质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体（plasimid vectors）1 1、质粒载体的生物学特性、质粒载体的生物学特性2 2、质粒载体相关知识介绍、质粒载体相关知识介绍1.质粒载体的生物学特性（1 1）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以以 外的能自主的复制外的能自主的复制的裸露的的裸露的环状双链环状双链DNADNA分子分子，比病毒更简单。，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中和一些动植物细胞中也发现了质粒。目前也发现了质粒。目前对细菌的质粒研究得对细菌的质粒研究得比较深入，特别是

26、大比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。肠杆菌的质粒。质粒的不亲和性：质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。不能在同一宿主细胞中稳定共存。质粒的存在形式：质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋双螺旋3 3种。种。双螺旋共价闭合环双螺旋共价闭合环（超螺旋）（超螺旋）开环双螺旋（一开环双螺旋（一个裂口）个裂口）线状双螺旋线状双螺旋（两个裂口）（两个裂口）质粒质粒DNADNA的分子构型的分子构型质粒质粒DNADNA琼脂糖凝胶电泳模式图琼脂糖凝胶电泳模式图L:松弛线松弛线性的性的DNA 松弛开环的松弛开环的OCO

27、C构型构型 超螺旋的超螺旋的SCSC构型构型 作为基因工程载体，质粒至少应该具备作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制复制的起始区的起始区、选择标记基因区选择标记基因区、多克隆位点多克隆位点等等部分。部分。多克隆位点功能多克隆位点功能：用于插入外源用于插入外源DNADNA片段的特定区域，由一片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成。系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成。特点：特点：每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：选择标记基因：在基因工程中的在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的一类用于选择转化细胞（菌

28、）的抗性基因抗性基因。功能：功能：通过在培养基中加入特定通过在培养基中加入特定的的抗生素抗生素就可以选择得到转化的就可以选择得到转化的细胞（菌）。细胞（菌）。 -互补互补 (alpha-complementation) 大肠杆菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作用并且相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的释放出一种蓝色物质，当该酶的 -片段和片段和 -片段分开时就失片段分开时就失去了这种显色的功能。去了这种显色的功能。 通常将编码该酶通常将编码该酶 -片段的片段的LacZ 基因插入到载体的多克隆基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中。位点的侧翼序列中。

29、 在一些在一些人工构建的大肠杆菌株系中人工构建的大肠杆菌株系中只能编码产生该酶的只能编码产生该酶的 片段片段。这样一来，含有功能性完整的。这样一来，含有功能性完整的LacZ 基因的载体导入基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的到这类寄主细胞中时，载体编码的 -片段片段就能和寄主编码的就能和寄主编码的 片段片段发生互补并具有了对底物发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为是反应），这种现象被称为是 alpha-complementation。 所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和和

30、诱导物诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。互补显色反应互补显色反应 pBR322质粒载体质粒载体 “P”表示是一种质粒；表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建表示两位主要构建者姓氏的头一个字母者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。表示实验编号。pBR3224363重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性

31、菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切加反应液 AmpTet + Amp连接pBR3224363pUC质粒载体质粒载体在在pBR322的基础上，组的基础上，组入了一个在其入了一个在其5-端带有端带有一段多克隆位点的一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有基因，而发展的具有双双功能检测特性功能检测特性的新型质的新型质粒载体系列。粒载体系列。pUC质粒载体的优点质粒载体的优点:第一，具有来自大肠杆菌第一，具有来自大肠杆菌lac操纵子的操纵子的lacZ基因。基因。 所编码的所编码的-肽链可参与肽链可参与- 互补作用，用互补作用，用X-gal显色对重显色对重组子进

32、行鉴定，而组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选质粒的重组子要进行两步的选择。择。 第二，具有多克隆位点第二，具有多克隆位点MCS区段。区段。 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。穿梭质粒载体（穿梭质粒载体（ shuttle plasmid vector ） 是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的择标记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。质粒载体。酵母酵母ARSn ARS (autonomously replicating seq

33、uence自主复制自主复制序列序列)-)-染色体自主复制序列染色体自主复制序列, ,是从酵母中克隆的真核细是从酵母中克隆的真核细胞胞DNADNA复制起点序列。复制起点序列。n 酵母每条染色体由多个复制子组成酵母每条染色体由多个复制子组成, ,复制子平均长度为复制子平均长度为36kb36kb。n 整个基因组约由整个基因组约由400400多个复制子组成。多个复制子组成。5-XTTXATXTXTX-3B1 B2B3ACS:ACS:能被复制起始位点蛋能被复制起始位点蛋白白ORCORC专一性识别专一性识别也是ORC识别序列是转录因子是转录因子ABFABF1 1的识别位点且的识别位点且B B3 3可以远在

34、可以远在1kb1kb以外同样促以外同样促进复制进复制CA A元件决定哪一段元件决定哪一段DNADNA序列作为复制起始位点，序列作为复制起始位点，B B元件可以增元件可以增加复制起始位点的效率。加复制起始位点的效率。 可能参与可能参与DNADNA双链双链的解旋的解旋酵母整合质粒酵母整合质粒(YIps)酵母整合质粒酵母整合质粒( (YIps) )：细菌质粒细菌质粒含有一个酵母基因。是在含有一个酵母基因。是在pBR322pBR322的基础上插入了一个的基础上插入了一个URA3URA3基因，基因，这个基因编码乳清酸核苷这个基因编码乳清酸核苷-5-5-磷酸脱羧酶，可以作为选择标记。磷酸脱羧酶，可以作为选

35、择标记。YIpYIp不能像质粒一样复制，其复不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母的染色体上。制依赖于整合到酵母的染色体上。YIP51000bpURA3AMPr酵母附加质粒酵母附加质粒( (YEps) ) YEpsYEps可以含有完整的可以含有完整的2 2m m质粒，质粒，也可以只含有也可以只含有2 2m m质粒的复制质粒的复制起点；因为在载体中作为选起点；因为在载体中作为选择标记的基因与突变体主染择标记的基因与突变体主染色体色体DNADNA同源性很高，可以独同源性很高，可以独立的复制也可以整合到酵母立的复制也可以整合到酵母的染色体内。的染色体内。来自于来自于2 2m m质粒的载体称为酵母

36、附加载体或者质粒的载体称为酵母附加载体或者YEpsYEps。 YEpYEp克隆载体（酵母游离型质粒）克隆载体（酵母游离型质粒） 2m2m质粒的质粒的orioriEcoREcoR酶切酶切 pBR322pBR322质粒质粒 酵母染色体酵母染色体URA3URA3基因基因HindHind酶切酶切 YEp24 YEp24 （图（图3-113-11） 特征特征（1 1）保留了）保留了pBR322pBR322的的和和筛选大肠杆筛选大肠杆菌克隆子菌克隆子（2 2）含）含URA3URA3标记标记筛选酵母菌克隆子筛选酵母菌克隆子 （3 3）URA3URA3基因基因补偿酵母菌补偿酵母菌ura3ura3突变突变 优点

37、优点（1 1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制制（2 2）转化率高，）转化率高，1gDNA1gDNA可获得约可获得约10104 410105 5个克隆子个克隆子（3 3）稳定高拷贝复制）稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因故可用酵母菌高水平表达外源目的基因含有酵母的筛选标记含有酵母的筛选标记ura3ura3和和DNADNA的自主复制序列的自主复制序列ARSARS在真核在真核细胞中独立自主的复制，拷贝细胞中独立自主的复制，拷贝数高但不稳定。数高但不稳定。酵母复制质粒（酵母复制质粒（YRpYRp）YRP1000bpURA3AMPrA

38、RS在复制质粒中再插入酵母着丝在复制质粒中再插入酵母着丝粒粒(centromer)(centromer)的一个的一个DNADNA片段片段(CEN)(CEN)，帮助染色体能等量地，帮助染色体能等量地分配到子代细胞中。所以，含分配到子代细胞中。所以，含有有CENCEN序列的质粒也将以同样序列的质粒也将以同样的机制稳定地维持在细胞中，的机制稳定地维持在细胞中，并保证了稳定质粒在子代细胞并保证了稳定质粒在子代细胞中的等量分布。中的等量分布。酵母稳定质粒酵母稳定质粒 (YCp)(YCp)URA3AMPrARSCENYCP1000bpAMPrARSURA3CEN质质 粒粒大大 小小大肠杆菌大肠杆菌复制子复

39、制子酵母酵母复制子复制子大肠杆菌大肠杆菌选择表型选择表型酵母选择酵母选择表型表型转化频率转化频率gDNAgDNA-1-1YIP5整合型5541bpPMB1无AprTetrUra+1100YRP17复制型7002bpPMB1ARS1AprTetrTrp+Leu+103105YEp13附加体型10.7kbPMB12mAprTetrLeu+103105YCp 9着丝粒型10.1kbPMB1ARS1AprTetrTrp+Ura+103104酵母菌穿梭质粒特性酵母菌穿梭质粒特性一、一、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（一）（一） 噬菌体性质噬菌体性质DNA + DNA + 外壳蛋白外壳蛋白1 1、DNA (

40、48.5kb) DNA (48.5kb) 噬菌体中：线性噬菌体中：线性宿主细胞：环状宿主细胞：环状(cos(cos位点位点) )A W B C D E F Z U V G T H M L K I J ins xis exo red gam att位点CIII N CI Cro CII O P QS头 部尾 部b 2区重 组 基 因正 负 调 控 基 因裂 解右侧区内包含所有的右侧区内包含所有的调控因子、与调控因子、与DNA复复制及裂解宿主菌有关制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约的基因，这个区域约长长12kb。左侧区包括使噬左侧区包括使噬菌体菌体DNADNA成为一个成为一个成熟的、有外壳成熟的

41、、有外壳的病毒颗粒所需的病毒颗粒所需的全部基因，全的全部基因，全长约长约20kb20kb。中间区域约长中间区域约长18kb18kb，这一段这一段DNADNA可以被外可以被外源置换而不会影响噬源置换而不会影响噬菌体菌体裂解生长的能裂解生长的能力。力。A W B C D E F Z U V G T H M L K I J ins xis exo red gam att位点CIII N CI Cro CII O P QS头部尾部b2区重组基因正负调控基因裂解DNA 基因结构基因结构 B2B2区区和和重组基因区重组基因区是是噬菌体进入裂解周期的非必需区噬菌体进入裂解周期的非必需区（15kb 15kb

42、，约占，约占噬菌体噬菌体DNADNA的的1/31/3 ），可将该区缺失或），可将该区缺失或用外源用外源DNADNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响。成影响。60%60%区域为裂解生长所必需。区域为裂解生长所必需。cI基因：溶源过程控制基因基因：溶源过程控制基因 噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷： 基因组太大（基因组太大（49kb）；）；酶切点太多酶切点太多:有有5个个BamH位点，位点，6个个Bg位点位点5个个 EcoR位点。位点。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。构建构建噬菌体载体的基本原理噬菌体载体的基本原理 切去非必须区

43、段，在切去的同时，加载目的切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（基因（2.5kb或更大）；或更大）； 去掉太多的酶位点，每种酶只留去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口； 增加标记基因增加标记基因:噬菌体重组体分子不具抗生素噬菌体重组体分子不具抗生素抗性选择标记，主要是依据抗性选择标记，主要是依据X-gal-IPTG显色反应显色反应来筛选重组子和噬菌斑的形态学特征。来筛选重组子和噬菌斑的形态学特征。 按照这一基本原理构建的按照这一基本原理构建的噬菌体的派生载体，可以归噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：纳成两种不同的类型：插入型载体（插入型载体（insertion ve

44、ctors），），只具有一个可供只具有一个可供外源外源DNA插入的克隆位点。插入的克隆位点。替换型载体（替换型载体（rePlacement vectors），），具有成对的具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源区段可以被外源插入的插入的 DNA片段所取代。片段所取代。 噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。文库或基因组文库的构建。 2.组装组装1.连接连接3.侵染侵染Why? 由于由于噬菌体包装时，当噬菌体包装时，当DNADNA的长度短于野

45、生的长度短于野生型的型的78%78%或超过或超过105%105%时，噬菌体的活性就急剧时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型下降。因此只包装它的野生型DNADNA（48.5KB48.5KB）的的75%75%105%105%左右的左右的DNADNA，要求，要求载体载体DNADNA和外和外源源DNADNA长度之和在长度之和在393953kb53kb之间。之间。 插入式载体可携带的外源插入式载体可携带的外源DNADNA片段较替换式片段较替换式为小。为小。 gt10 gt10 载体载体 替换了一段来自替换了一段来自 434 噬菌体的片段噬菌体的片段 imm434 ，其中基因，其中基因 c 内

46、内有一个有一个 EcoR 位点。位点。 EMBL3EMBL3 在填充片段两端带有在填充片段两端带有对称的多克隆位点对称的多克隆位点 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 cosmid vectorscosmid vectors一类由人工构建的含有一类由人工构建的含有DNA的的 cos序列序列和和质粒复制子质粒复制子的特的特殊类型的质粒载体。该载体在体外重组后，可利用噬菌体殊类型的质粒载体。该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是导入受体细胞。但它不会产生子代噬

47、菌体，而是以质粒以质粒DNA的形式存在于细胞内。的形式存在于细胞内。柯斯质粒载体柯斯质粒载体 cosmid vectors “cosmid”一词是由英文一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而缩写而成的，其原意是指成的，其原意是指带有带有粘粘性末端位点（性末端位点（cos）的质）的质粒粒，又称又称其为其为粘粒载体粘粒载体。粘粒载体粘粒载体 cosmid具有具有 噬菌体的特性：噬菌体的特性：cosmid vector的特点的特点 克隆外源克隆外源DNADNA后可以后可以体外包装体外包装成噬菌体颗粒。成噬菌体颗粒。在寄主细胞内形成环化在寄主细胞内形成环化DNADNA

48、（但不能形成新的噬菌（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。体颗粒而溶菌）。具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性方便选择方便选择高容量的克隆能力：高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于（最少不能低于30kb）。）。 凡具有凡具有cos位点的任何位点的任何DNA分子只要其长度相当分子只要其长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源外源DNA可大于可大于40kb。重组的柯斯质粒可像噬菌。重组的柯斯质粒可像噬菌体体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。一样感染大肠

49、杆菌，并在细菌细胞中复制。柯斯克隆理论依据是柯斯克隆理论依据是: :1 1）在线性噬菌体）在线性噬菌体DNADNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（链突出序列（coscos位点位点) )。2 2）在）在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNADNA拷拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个前后两个DNADNA基因组之基因组之间都是通过间都是通过coscos位点连接起来的。位点连接起来的。3 3）噬菌体具有的一种位点特异的切割体系噬菌体具有的一种位点特异的切割体系

50、(site-specific (site-specific cutting system),cutting system),又叫又叫TerTer体系，体系，能识别两个相距适宜的能识别两个相距适宜的coscos位位点点(38-45kb)(38-45kb)，将多连体分子切割成将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它单位长度的片段，并将它们包装到们包装到噬菌体头部中去。噬菌体头部中去。 2022-5-7104南京农业大学 生命科学学院人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体（人工染色体载体（artificial chromosome artificial chromos

51、ome vecter)vecter) : :又叫大分子又叫大分子DNADNA克隆载体，利用染克隆载体，利用染色体的色体的复制元件复制元件来驱动外源来驱动外源DNADNA片段片段复制复制的载的载体。体。（1）自主复制序列（自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（复制起始点（ori）染色体复制和遗传的三个基本组件：染色体复制和遗传的三个基本组件：TELTELCENORI（2）着丝粒（）着丝粒（centromere，cen）（3）端粒（）端粒（telomeres，tel）人工染色体载体人工染色体载体酵母人工染色体载体（酵母人工染色

52、体载体（YACYAC）细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（BACBAC）黏粒载体（黏粒载体（cosmid)cosmid)P1P1人工染色体载体（人工染色体载体（PACPAC）YAC的组成结构的组成结构 3.5.YAC载体的载体的选择选择标记及标记及筛选筛选标记标记选择选择标记：营养缺陷型基因标记：营养缺陷型基因筛选筛选标记：标记： SUP4宿主酵母菌：宿主酵母菌：trp- 和和 ura- 插入失活选择：插入失活选择：SUP4酶失活的酵母菌落呈酶失活的酵母菌落呈红色；红色； 不失活的菌落是白色。不失活的菌落是白色。（赭石突变抑制基因：（赭石突变抑制基因：UAA）ade2-1转化转化Ura-/

53、Tra-YAC工作原理工作原理4.基因克隆的方法基因克隆的方法 基因的分离基因的分离 基因克隆：就是利用基因克隆：就是利用DNA重组技术及其它重组技术及其它相关技术，相关技术，获得目的（外源）基因获得目的（外源）基因（DNA片段）并插入适当的片段）并插入适当的载体载体DNA分子分子中，并中，并能自我能自我“复制复制”，获得大量目的基因，获得大量目的基因（DNA片段）的过程。片段）的过程。 目的基因的制备目的基因的制备:n构建基因组文库构建基因组文库n构建构建cDNA基因文库基因文库n利用聚合酶链式反应技术利用聚合酶链式反应技术n基因的化学合成基因的化学合成基因文库基因文库基因文库基因文库基因组

54、文库基因组文库cDNA文库文库 基因组文库：基因组文库：来源于基因组来源于基因组DNA，反映，反映基因组的全部基因组的全部信息信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。形式等。 cDNA文库：文库：来源于细胞表达出的来源于细胞表达出的RNA，反映基因组，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。达状态和表达基因的功能等。 基因组文库构建 用克隆载体将某种生物的基因

55、组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。n文库能够覆盖整个基因组；n插入的片段比较大；n文库比较稳定，且容易保存和操作。基因组文库必须符合的基本条件基因组文库的大小：基因组文库的大小：nN=ln(1-P)/ln(1-f)N=ln(1-P)/ln(1-f)nN N：文库必需的克隆数：文库必需的克隆数nP P：文库中目的：文库中目的DNADNA片段的出现概率片段的出现概率 nf f：插入片段大小：插入片段大小/ /全基因组大小的比值全基因组大小的比值 期望值为期望值为0.990.99，插入片断为，插入片断为20kb20kb的的 E.coli E.coli (4.6(4.

56、610106 6 bp) bp) 和和 human (3human (310109 9 bp) bp) 基因组的克隆数的计算基因组的克隆数的计算N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。有一些序列不能被克隆有一些序列不能被克隆Example:Example: 1. 1.序列缺乏酶切位点序列缺乏酶切位点; ; 2. 2

57、.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的载能力的DNADNA片段上。片段上。Too long for the vector used植物基因组文库构建的基本步骤：植物基因组文库构建的基本步骤：n大片段大片段DNADNA克隆载体的准备；克隆载体的准备；n大分子质量的植物基因组大分子质量的植物基因组DNADNA制备；制备；n大片段大片段DNADNA分子的部分酶切；分子的部分酶切；n载体与外源片段的连接；载体与外源片段的连接；n载体的遗传转化。载体的遗传转化。载体的选择载体的选择 根据基因组的大小选择合适的载体构建根据基因组的大小选择合适的载体构建DNA

58、DNA文库。文库。 载载 体体 Plasmid phage cosmid BAC YAC 插入片断插入片断 (kb) 5 23 45 350 1000 利用利用质粒载体质粒载体 构建基因组文库构建基因组文库BamHIMboIOHPOHHO脱磷酸化重组DNAT4 连接酶转化E.coli基因组文库总DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36 kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI该法简单、快速、易于该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。等真核生物和原核生物。利用

59、利用噬菌体噬菌体构建基因组文库构建基因组文库利利用用考考斯斯质质粒粒构构建建基基因因组组文文库库利用利用YACYAC构建基构建基因组文库因组文库cDNA文库文库 cDNAcDNA文库文库(completement (completement DNA Library)DNA Library)：某生物基因组：某生物基因组转录的全部或部分转录的全部或部分mRNAmRNA经反转经反转录产生的各种录产生的各种cDNAcDNA片段，分别片段，分别与载体重组而存在于一种受体与载体重组而存在于一种受体的群体，即的群体，即cDNAcDNA基因基因( (部分部分) )文文库。库。基因组文库基因组文库 包含该生物基

60、因组包含该生物基因组DNADNA全部的序列；全部的序列； 是具有生物种属特异性的。是具有生物种属特异性的。cDNAcDNA文库文库 已经过剪接、去除了内含子的已经过剪接、去除了内含子的cDNAcDNA； 具有组织细胞特异性。具有组织细胞特异性。cDNAcDNA文库的构建文库的构建载体载体cDNAcDNA片段的制备片段的制备 分离细胞总分离细胞总RNARNA； 以以mRNAmRNA为模板，合成为模板，合成cDNAcDNA第一链；第一链； 双链双链cDNAcDNA的合成。的合成。 mRNAmRNA纯化的方法：纯化的方法： 以寡聚（以寡聚（dTdT）- -纤维素柱层析法最为有效。纤维素柱层析法最为有