第七章 重组与鉴定 2014

1、切接转增检5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGTACTAG 55 GATCAT5 5 TGATCAACTAGT5 GCCTAGGATCC5 TACTAG GATCATGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 G

2、ACGTC3 CGATCCGCTAGG5 GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 3 5 CG5 GC5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG555GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 5GGATCCCTAGGATCCCTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGCTG

3、CA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG同聚物加尾法同聚物加尾法o不需要模板o存在单一的脱氧核苷酸o有带3-OH的单链延伸末端oTdTa.用5末端特异的核酸外切酶处理片断A，B。形成延伸的末端b.分别加入d ATP,

4、dTTP及末端转移酶，各自形成多聚尾巴c.退火；d.转化大肠杆菌挑选重组子衔接物(linker):用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成,具有一个或数个限制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核苷酸片段.5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAA pAATTCG5 pGCTTAA OH 55 AATTCG5 HO5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHOROPROISal IBamH ITetPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAmporipBR3224363 bppUC18AmplacZoripGEM-T -DFL4265bpLacZoriNot IPst ISac IBstZ IAmpNotIDFLf1 oriApa IBamHIEcoR IEcoRINstINotISpnISacIAatIGACCTAAAGCGGATCGTAGGT