基因工程5-3 基因分离、重组及重组体向受体细胞导入

1、5.2 目的基因片段与载体目的基因片段与载体DNA的连接的连接5.2.1 粘性末端粘性末端DNA片段的连接片段的连接 大多数的限制性核酸内切酶都能够切割DNA分子，形成具有14个核苷酸的粘性末端。当载体和外源给体DNA用同样的限制酶，或是用能够产生相同的粘性末端的限制酶切割时，所形成的DNA末端就能够彼此退火，并被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。当然，所选用的核酸酶对克隆载体DNA分子最好只具有一个识别位点，而且还是位于非必要的区段内。 5.2.1.1 插入式插入式 （单酶切）（单酶切） 这种方法引导的外源DNA片段的插入，可以有两种彼此相反的取向，这对于基因克隆是很不方便的。 5.

2、2.1.2 取代式（双酶切）取代式（双酶切） 根据限制性核酸内切酶作用的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。如果载体分子和待克隆的DNA分子，都是用同一对限制酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。这就是所谓的定向克隆(directional cloning)技术，可以使外源DNA片段按一定的方向插入到载体分子上。 5.2.2 非互补粘性末端非互补粘性末端DNA片段的连接片段的连接 载体分子和给体DNA片段经不同的限制酶切割后，并不一定总能产生出互补的粘性末端，多为非互补的粘性末端或平末

3、端。对于平末端的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶在一定的反应条件下进行连接；而具有非互补粘性末端的DNA片段，经单链特异性的S1核酸酶处理变成平末端之后，也可以使用T4 DNA连接酶进行有效连接。 但是，平末端DNA片段之间的连接作用，在效率上明显地低于粘性末端之间的连接作用，而且重组之后便不能在原位删除下来。现在基因克隆实验中，常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。 5.2.2.1 同聚物加尾法同聚物加尾法 这种方法的核心是利用末端脱氧核苷酸转移酶的特殊功能，此酶能够将单核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3OH上，该过程不需要模板。当反应物中只存在一

4、种脱氧核苷酸时，便能够构成由同一种类型的核苷酸组成的尾巴，其长度可达100个核苷酸。 为了在平末端的DNA分子上产生出带3OH的单链延伸末端，需要先用5特异的核酸外切酶，或者Pst I一类的内切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸。这样在加有dATP和末端酶的反应混合物中，DNA分子的3末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸，这样的延伸片段，称之为poly(dA)尾巴。如果在反应混合物中加入的是dTTP而不是dATP，则形成poly(dT)尾巴。这两种尾巴是互补的，同样poly(dG)尾巴和poly(dC)尾巴也是互补的，可以使两个不同的DNA分子彼此连接起来。 同聚物尾巴

5、的长度没有严格限制，一般只要1040个残基就够了。但由于poly(dA)和poly(dT)，poly(dG)和poly(dC)通常是不会严格等长的，这样形成的重组体DNA分子上便会留有缺口或裂口，因此需要用大肠杆菌DNA聚合酶I或Klenow大片段去填补，然后再用DNA连接酶封闭缺口。 这种修复反应不一定要在体外试管中进行，如果互补的一对同聚物尾巴长度超过20个核苷酸，它们结合形成的碱基对结构相当稳定，这样的重组体分子可以直接导入受体细胞中，由细胞内部的DNA聚合酶和DNA连接酶对其进行修复。 5.2.2.2 用衔接物连接平末端用衔接物连接平末端DNA片段片段 所谓衔接物(linker)，是指

6、用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来；接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，使二者都产生出了彼此互补的粘性末端，这样就可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。 衔接物连接法兼具有同聚物加尾法和粘性末端法各自的优点，而且它可以根据实验的要求，设计具有不同限制酶识别位点的衔接物，并大量制备，以增加其在体外连接反应混合物中的相应浓度，从而极大地提高了平末端DNA片

7、段之间的连接效率。 用衔接物连接法获得的重组体分子，只要用同样的限制酶在插入位点切割，便可以重新分离出原来的DNA插入片段，方便于克隆片断的再删除或进一步研究；而用T4 DNA连接酶的平末端连接法，或是同聚物加尾法构建的重组体DNA，就无法用原来的限制酶作特异性的切割，因而不能获得插入的DNA片段。 5.2.2.3 用接头连接平末端用接头连接平末端DNA片段片段 在应用衔接物连接法时，如果待克隆的DNA片段或基因的内部，含有与所加的衔接物相同的限制位点，则在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆基因切成不同的片段，给后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。这时可以改用DNA接头连接法。 DNA接

8、头(adapter)是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 接头与衔接物的区别在于，接头是一个具有粘性末端的短核苷酸双链，它与平末端DNA连接后，不用经过切割就可以与载体相连。 为防止各个DNA接头分子的粘性末端之间通过互补配对形成二聚体分子，通常要对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，使其平末端仍与天然双链DNA分子一样，具有正常的5P和3OH末端结构，而其粘性末端5P则被修饰移走，被暴露出来的5OH所取代。 这样，虽然两个接头分

9、子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但因为DNA连接酶无法在5OH和3OH之间形成磷酸二酯键，而不会产生出稳定的二聚体分子。但它们的平末端照样可以与平末端的外源DNA片段正常连接，只是在连接之后需用多核苷酸激酶处理，使异常的5OH末端恢复成正常的5P末端，让其可以插入到适当的克隆载体分子上。 5.2.3 连接反应条件连接反应条件1. 为了使连接反应物中有尽可能多的外源DNA片段都能插入载体分子形成重组DNA ，必须尽量避免经限制酶切割后线性载体分子自身的再环化作用，以提高DNA片段的插入效率。采取的措施有：(1) 采用不同的限制酶进行切割，如BamH I和Hind III的粘性末端不同，自

10、身无法环化。 (2) 用碱性磷酸酶处理由限制酶消化产生的线性载体分子，除去载体DNA的5P末端，而留下5OH基团，这样的线性载体分子，除非插入了外源DNA片段，否则就不能重新环化成有功能的载体分子。 (3) 使用同聚物加尾连接技术，可以自动地防止线性载体DNA分子自身再环化作用，这是因为切割后形成的线性DNA分子的两个3OH末端，都被加上了具有同样碱基结构的同聚物尾巴。 (4) 应用柯斯质粒，也可以防止质粒DNA分子发生自身的再环化作用。 防止线性载体分子发生自身再环化作用十分重要，因为载体分子的重建，会导致非重组噬菌斑或抗药性菌落的大量产生，结果使非重组体克隆的比例大幅度上升，从而也增加了选

11、择或筛选重组体克隆的工作量。 2. 在连接反应中，正确的选择载体DNA和外源DNA之间的比例，是能否获得高产量的重组体转化子的一个重要因素。 (1) 用噬菌体或柯斯质粒作载体时，连接反应体系中载体DNA / 给体DNA的比例高，有利于重组体分子的形成，这是因为只有当给体DNA片段的两个末端都同载体分子结合之后，才能被有效地包装。 (2) 用质粒分子作为克隆的载体，载体DNA与给体DNA的比值为1时，有利于重组体分子的形成，因为这类重组体分子是由一个载体分子和一个给体DNA片段连接环化而成的。 3. 在体外连接反应中，DNA的总浓度对形成什么样的DNA分子类型也会有所影响。一般低浓度（低于20g

12、 DNA/mL）时，DNA分子间的相互作用机会少，有利于环化作用；而高浓度的DNA（高于300400g DNA/mL），则有利于形成长的多连体DNA分子。 4. 连接反应的温度也是影响连接效果的一个重要因素，研究表明，在4下保温4h，没有出现任何转化子；而在26下连接1h就会产生很多的转化子。事实上，在26下连接4h所得的转化子数目，大约是4下连接23h的90%，而且是在4下连接4h的25倍以上。因而连接反应通常可以在室温下进行。 16（用冰浴调节温度），612小时。 5.3 重组体向宿主细胞的导入重组体向宿主细胞的导入 带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行

13、繁殖，才能获得大量的纯一的重组体DNA分子，这一过程叫做基因的扩增。 将外源重组体分子导入受体细胞的途径有多种，其中转化（或转染）和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。 选定的寄主细胞必须具备使外源DNA进行复制的能力，而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。 在所有的关于重组DNA的研究工作中，都使用了大肠杆菌K12突变体菌株，该菌株由于丧失了限制体系，故不会使导入细胞内的未经修饰的外源DNA发生降解作用。对于大肠杆菌寄主，无论是转化还是转导，都是十分有效的导入外源

14、DNA的手段。 5.3.1 重组体重组体DNA分子的转化或转染分子的转化或转染 转化（transformation）严格地说是指将质粒DNA分子引入大肠杆菌细胞的过程；而转染则是指噬菌体DNA分子转入大肠杆菌细胞的过程。从本质上讲，两者并没有根本的区别。 无论转化还是转染，其关键因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性。细菌转化（或转染）的具体操作程序是： (1) 选取新鲜幼嫩的受体细胞（如大肠杆菌HB101），培养一定时间使其OD550nm达到0.5；将培养好的细胞放在冰浴中冷冻10min，然后在4000 rpm下离心5min，收集沉淀细胞。 (2) 将沉淀细胞重新悬浮在预冷的无菌

15、的50mM CaCl2和TrisHCl (pH 8.0)中，放置冰浴5min，同样离心收集沉淀细胞，重新悬浮，即成为感受态细胞，冰冻备用。 (3) 取出冰冻感受态细胞，加入连接反应混合物（重组DNA），在42水浴中作2min的热刺激（让外源DNA进入细胞内）。 (4) 如果使用的是噬菌体DNA（即转染过程），那么可以将经过上述处理的细菌直接涂布在培养基平板上，于37下培养，此时已经捕获了DNA的细胞经过一段时间后，会释放出大量的子代噬菌体颗粒，如此重复下去，最终会在平板的细菌菌苔上形成噬菌斑。 (5) 如果使用的是质粒的DNA（即转化过程），那么首先应将细菌放置在非选择性的LB培养基中，37保

16、温一段时间，以促使在转化过程中获得的新的表型（Tetr或Ampr）得到充分的表达，然后将此细菌培养物涂布在含有四环素或氨苄青霉素的选择性平板上。 注意控制转化条件，使每个细胞只进入一个重组体质粒DNA分子，在选择性平板上一个转化子细胞便会生长成为一个单菌落。每一个这样的菌落都只含有一种来源于同一个转化质粒的同源质粒群体，这样的单菌落通常又称为克隆。 在普通的转化实验中，每微克pBR322质粒DNA可以获得106左右的转化子菌落，每微克噬菌体的DNA可以获得104106噬菌斑。然而当使用重组DNA分子进行转化时，转化的频率一般要下降102104倍，这是因为：一方面由于载体分子同插入DNA片段间的

17、连接作用经常是无效的，结果便大大地降低了有功能的质粒或噬菌体DNA的实际数量；另一方面由于含有插入DNA片段的载体分子一般都比较大，这样也会导致转化（或转染）的频率再度明显下降。 因此，为了提高转化的频率必须采取必要的措施，抑制那些不带有外源插入DNA片段的噬菌体DNA或质粒DNA分子形成转化子菌落。应用碱性磷酸酶处理法，可以阻止不带有插入DNA片段的载体分子发生自身再环化的作用，从而提高了转化效率。 5.3.2 重组体的体外包装及重组体的体外包装及 噬菌体的转导噬菌体的转导 另一种将外源重组DNA分子导入寄主细胞的方法，即所谓的体外包装颗粒的转导，它先将重组的噬菌体DNA或重组的柯斯载体DN

18、A，包装成具有感染能力的噬菌体颗粒，然后经由在受体细胞表面上的 DNA接受器位点，使这些带有目的基因序列的重组体DNA注入大肠杆菌寄主细胞。 在第四章中已经讨论过，将外源重组的 DNA包装成为具有感染活性的噬菌体颗粒，需要从两株对噬菌体溶源性的大肠杆菌中制备出一对互补的提取物。例如，在噬菌体外壳蛋白质基因A和E发生了无义突变的两个溶源性菌株（如NS1128和433），或者是在噬菌体基因D和E发生了无义突变的两个溶源性菌株（如BHB2690和2688）。 从突变体D菌株纯化的蛋白质提取物，含有大量未成熟的噬菌体头部前体颗粒，从突变体A菌株纯化的蛋白质提取物，同样也含有大量中空的头部前体颗粒，而从突变体E菌株纯化的蛋白质提取物中，积累了大量的尾部蛋白质。因此，E菌株的提取物可同另一种含有中空的头部前体颗粒的D菌株（或A菌株）的提取物互补，完成噬菌体的形态建成。 在良好的体外包装反应条件下，每微克野生