高效液相色谱分析(12)

1、高效液相色谱高效液相色谱 液相色谱分离系统也由两相液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。物由流动相液体推动进入色谱柱。 根据组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系根据组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸的差异进行分离。数、离子交换作用或分子尺寸的差异进

2、行分离。高效液相色谱的优点高效液相色谱的优点实现高效的分离实现高效的分离:填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高，可以在数分钟内均匀、传质阻力小，因而柱效很高，可以在数分钟内完成数百种物质的分离完成数百种物质的分离快快: HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟度极快，只需数分钟。 高灵敏度高灵敏度:检测器灵敏度极高：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测荧光检测器器10-11g。 应用范围广应用范围广: HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定可以分析高沸点、高分子量的稳

3、定或不稳定化合物或不稳定化合物流动相可选择范围广流动相可选择范围广 馏分容易收集馏分容易收集高效液相色谱的缺点高效液相色谱的缺点价格昂贵，要用各种填料柱。价格昂贵，要用各种填料柱。容量小，分析生物大分子和无机离子困难。容量小，分析生物大分子和无机离子困难。流动相消耗大且有毒性的居多。流动相消耗大且有毒性的居多。高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。互作用。而在液相色谱中，流动相液体

4、也与固定相争夺而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。选择性。 液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。色谱分离条件的选择。由于液体的扩

5、散性比气体的小由于液体的扩散性比气体的小10105 5倍，因此，溶质在液倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而而且回收是定量的，适合于大量制备且回收是定量的，适合于大量制备。理论基础理论基础速率方程（速率方程（Giddins方程）方程） H=He+Hd+Hs+Hm+Hsm1、涡流扩散相、涡流扩散相 He2dp 减小粒度，提高柱内填料装填的均匀性减小粒度，提高柱

6、内填料装填的均匀性 2、纵向扩散相、纵向扩散相 Hd(CdDm )/u 粘度大，柱温为室温，粘度大，柱温为室温，Dm小，当小，当u大于大于1cm/s时，时， Hd可忽可忽略。略。3、固定相传质阻力项、固定相传质阻力项 Hs（Csdf2/Ds )u 液液色谱液液色谱薄的固定相层薄的固定相层 化学键合相化学键合相单分子层单分子层,可忽略可忽略 吸附、排阻、离子交换色谱小的颗粒填料吸附、排阻、离子交换色谱小的颗粒填料4、流动相传质阻力项、流动相传质阻力项 Hm=（Cmdp2/Dm )u5、滞留流动相传质阻力项、滞留流动相传质阻力项 Hsm=（Csmdp2/Dm )u速率方程速率方程H=2dp+ (C

7、dDm )/u +(Csdf2/Ds + Cmdp2/Dm+ Csmdp2/Dm )uH=A+Cu=A+(Cs+Cm+Csm)u色谱柱、流动相、流速等考虑色谱柱、流动相、流速等考虑（柱填料颗粒较小、填充均匀、流速较低时，（柱填料颗粒较小、填充均匀、流速较低时，H较小；流动相较小；流动相粘度较低、柱温较高时，粘度较低、柱温较高时，H较小。降低较小。降低H，可选用较小颗粒，可选用较小颗粒的柱填料，填充均匀，较低的流动相流速；降低流动相粘度，的柱填料，填充均匀，较低的流动相流速；降低流动相粘度，升高柱温等。）升高柱温等。）高效液相色谱仪高效液相色谱仪HPLCHPLC仪器包括：仪器包括： 高压输液装置

8、高压输液装置; ; 进样系统进样系统; ; 分离系统分离系统; ; 检测系统检测系统; ; 此外还配有梯度淋洗、此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装自动进样和数据处理装置。置。 首先首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，谱柱，然后然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱

9、图。器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。工作过程工作过程He储液瓶储液瓶分布器分布器过滤过滤2 m高压泵高压泵入口检查入口检查出口检查出口检查脉流消除脉流消除抽气抽气过滤器过滤器反压调节反压调节压力计压力计注样阀注样阀分离柱分离柱到检测器到检测器高压输液系统高压输液系统 1）贮液器：）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金合金)，其孔约，其孔约2 m，可，可防止颗粒物进行泵内。防止颗粒物进行泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中

10、除去。对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵恒压泵(类似于风箱类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力(主要是主要是柱填充物柱填充物)变化而变化，现已较少使用。变化而变化，现已较少使用。 恒流型溶剂流量恒定，与

11、柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵 4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合 进样系统进样系统 与与G

12、C相比，相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样

13、品管控制，因此进样准确，重复性好可由样品管控制，因此进样准确，重复性好色谱柱色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为能小。柱长多为15-30cm，内径为，内径为4-5mm（尺寸排阻色谱柱常大于（尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大）；制备色谱柱内径更大）；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：平衡密度法： 即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于即使溶剂密度和填充颗粒密度相

14、近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：非平衡密度法： 当采用粘度较大的试剂，如当采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH，丙酮，二氧杂环己烷、，丙酮，二氧杂环己烷、THF（四氢呋喃）等。（四氢呋喃）等。填充方法：填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快（防凝聚、

15、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均要求填充速度快（防凝聚、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。匀性）。检测器检测器 液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。等。1）紫外检测器）紫外检测器 其检测原理和其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为吸收池，通常其光程为2-10mm, 体积约为体积约为1-10 L。最小检测浓度可达。最小检测浓度可达109g/mL，可用于梯度洗脱。，可用于梯度洗脱。 HPLC分析中，约有分析中，约

16、有80%的物质可以在的物质可以在254nm或或280nm处产生紫外吸处产生紫外吸收，因此该类检测器应用很广。收，因此该类检测器应用很广。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。长不能小于溶剂的最低使用波长。2）荧光检测器）荧光检测器 许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高检测器高2-3个数个数量级。量级。3）示差

17、折光检测器）示差折光检测器 利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。表样品的浓度。 为通用型检测器，灵敏度为为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。适于梯度淋洗。4）安培检测器）安培检测器 由恒电位仪和一薄层

18、反应池（体积为由恒电位仪和一薄层反应池（体积为15 L）组成。）组成。 该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。 采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。5）电导检测器）电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测。

19、电导检测器主要用于离子色谱的检测。 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH7时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。6 6）蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。如糖类、高级脂肪酸、磷

20、脂、维生素等化合物。的检测。如糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素等化合物。 通用质量型检测器，检测限一般为通用质量型检测器，检测限一般为8-10ng8-10ng。原理：组分先引入已通气体（原理：组分先引入已通气体（N N2 2，空气）的蒸发室，加，空气）的蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样品组分形成气溶胶而产热，使流动相蒸发而被除去，样品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射光强度而获得组分的浓度信号生光散射，测定散射光强度而获得组分的浓度信号流动相必须符合下列要求流动相必须符合下列要求： （1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。）能溶解样品，但不能与样品发生反应。 （2）与固定相不互溶，也不发

21、生不可逆反应。）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。 （3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。 （4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。要不吸收紫外光。 （5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。 （6）纯度：分析纯，最好色谱纯）纯度：分析纯，最好色谱纯常用溶剂极性常用溶剂极性： 水（最大）甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二水（最大）甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇醋酸乙酯乙

22、醚异丙氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇醋酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯氯丙烷甲苯四氯化碳醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯氯丙烷甲苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷庚烷煤油（最小）二硫化碳环己烷己烷庚烷煤油（最小）主要类型主要类型1 1.原理：吸附能力的差异原理：吸附能力的差异2.固定相固定相 极性：各种无机氧化物，酸性和碱性极性：各种无机氧化物，酸性和碱性 非极性：活性炭非极性：活性炭3.流动相流动相 极性大极性大-极性强的洗脱剂极性强的洗脱剂 极性小极性小-极性弱的洗脱剂极性弱的洗脱剂4.应用极性不同的化合物，对同系物没有选择性（即对分应用极性不同的化合物，对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用

23、该法分离分子量不同的化合物。子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱1.原理：利用组分在两相中溶解度的差异原理：利用组分在两相中溶解度的差异2.固定相：载体和固定液组成固定相：载体和固定液组成 （1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30-40 m的实心玻璃球和厚度约为的实心玻璃球和厚度约为1-2 m的多孔性外层所的多孔性外层所组成。组成。 （2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径径30-50 m的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。 （3）全多孔型微粒载

24、体，由）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为又称堆积硅珠。这种载体粒度为5-10 m。3.流动相：流动相与固定相互不相溶且极性大流动相：流动相与固定相互不相溶且极性大 正相分配色谱：固定相为极性，流动相为非极正相分配色谱：固定相为极性，流动相为非极性，适合于分离极性化合物性，适合于分离极性化合物. 反相分配色谱：固定相为非极性，流动相为极反相分配色谱：固定相为非极性，流动相为极性，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。性，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。4.应用：极性和非极性化合物应用：极性和非极性化合物离子交换色谱离子交换

25、色谱原理：原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：固定相固定相 高分子聚合物为基质的离子交换树脂。高分子聚合物为基质的离子交换树脂。按按离子交换剂类型分四种离子交换剂类型分四种：类类 型型官官 能能 团团阳离子交换剂阳离子交换剂强阳离子交换剂强阳离子交换剂-SO3-弱阳离子交换剂弱阳离子交换剂-CO22-阴离子交换剂阴离子交换剂强阴离子交换剂强阴离

26、子交换剂-NR3+弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂-NR2+按按固定相制作方法固定相制作方法可分为：可分为： 多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂( (包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型) )； 表面多孔型表面多孔型( (包括薄膜型）离子交换树脂；包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。1）多孔型：聚苯乙烯）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团联，分微孔型和大孔型。交换基团多多交换容量大，稳定。但易溶交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型：薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+

27、树脂薄层树脂薄层(1-2 m)多孔型多孔型=惰性惰性核核+硅胶微球硅胶微球+树脂薄层。克服了多树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型

28、表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂离子交换剂硅胶层涂覆覆流动相流动相 离子交换色谱流动相为离子交换色谱流动相为一定一定pH和一定浓度的缓冲液和一定浓度的缓冲液，通过改变，通过改变pH、缓、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比，改冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。pH值值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越

29、高，保留值越大。常用分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度离子强度I：对保留值的影响比对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或或R-的竞争能力，的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。不同物质对交换剂的亲和能力不同。有

30、机溶剂有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环己烷等。值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环己烷等。配离子配离子L：当大量当大量L、组分、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换： RM-L+XRM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。该法用于分离各种氨基酸或碱类。尺寸排阻色谱法（凝胶色谱）尺寸排阻色谱法（凝胶色谱） 尺寸排阻色谱又称凝胶尺寸排阻色谱又称凝胶( (渗透渗透) )色谱，主要用于大分子的分子分色谱，主要用于大分子的分子分

31、离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。用用来分析大分子物质相对分子质量的分布。来分析大分子物质相对分子质量的分布。特点特点：保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器；保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器；固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长；分子，因此柱寿命长；不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量

32、差别必须大于不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于1010才能得以分离。才能得以分离。原理原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于分子凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗中等体积的分子部分渗透；小分子可

33、完全渗透入内，最后洗出色谱柱。出色谱柱。 样品分子基本上按其样品分子基本上按其分子分子大小，排阻先后由柱中流出。大小，排阻先后由柱中流出。固定相固定相： 排阻色谱固定相种类很多，一般可分为排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性软性、半刚性和刚性凝胶和刚性凝胶三类。三类。 所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。体。软性凝胶软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其

34、微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。析，不适宜用在高效液相色谱中。 半刚性凝胶半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。效液相色谱时，流速不宜大。刚性凝胶刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性

35、溶剂，如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于一般控制压强小于7MPa，流速流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。径，造成不良分离。流动相：流动相： 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。溶剂也必须能溶胀凝胶。 溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩

36、散作溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。离，尤需注意。 非水溶性样品选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的非水溶性样品选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用有机物。机溶剂为流动相的凝胶色谱适用有机物。类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流

37、动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、刚性大、高高流速分离流速分离 有机溶剂和水有机溶剂和水 检测器检测器 凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱示差折光检测器示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射

38、率有较大差别。流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大差别。 谱图的特点：谱图的特点： 在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。展宽不同于其它液相色谱。 （）在低效排阻色谱法，样品分子大小随（）在低效排阻色谱法，样品分子大小随V V的增加而的增加而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大，因此在色急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大，因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。 （）在高效排阻色谱法，峰宽是个变量。（）在高效排阻色谱法，峰宽是个变量。体积排

39、阻色谱的影响因素体积排阻色谱的影响因素填料填料柱长：体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比。柱长：体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比。洗脱液洗脱液流速：蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要流速：蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。样品容量：进样体积和样品的浓度将明显地影响分离度。样品容量：进样体积和样品的浓度将明显地影响分离度。样品的浓度范围一般在样品的浓度范围一般在0.01%-0.5%.0.01%-0.5%.最好是高浓度、小最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋

40、白质的样体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的品体积为柱体积的1%-3%1%-3%比较合适。比较合适。亲和色谱亲和色谱 亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯

41、化或浓缩某一分子，也可以用来除去或减少混合物中化或浓缩某一分子，也可以用来除去或减少混合物中某一分子的含量。某一分子的含量。 原理原理 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合

42、的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。 应用应用 亲和色谱的用途很广泛，可以用来从细胞提取物中亲和色谱的用途很广泛，可以用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白，还可以从血浆中分离抗体。分分离纯化核酸、蛋白，还可以从血浆中分离抗体。分离重组蛋白就经常使用亲和色谱。通过基因修饰为蛋离重组蛋白就经常使用亲和色谱。通过基因修饰为蛋白加上一些人为的特性，这些特性使蛋白选择性地与白加上一些人为的特

43、性，这些特性使蛋白选择性地与配体结合，从而达到分离的目的。亲和色谱的另一大配体结合，从而达到分离的目的。亲和色谱的另一大用途是从血浆中分离抗体。用途是从血浆中分离抗体。 影响亲和色谱的因素影响亲和色谱的因素 1 1、上样体积、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱较小。若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的柱载量的5%-10%5%-10%。 2 2、柱长、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量亲

44、和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加高，与目标产物的作用力强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。柱子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 3 3、流速、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢，保证目标产物与配基之间有过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。

45、充分的时间结合，尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。 4 4、温度、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附能力受温度影响，温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质随温度的升高而下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用较高的温度，与配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，

46、便于待分离物质从配基上脱落。例使待分离物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。例如，一般选择在如，一般选择在44进行吸附，进行吸附，2525下进行洗脱。下进行洗脱。 吸附色吸附色谱谱分配色谱分配色谱离子色离子色谱谱体积排阻色体积排阻色谱谱亲和色谱亲和色谱固固定定相相全多孔全多孔固体吸固体吸附剂附剂固定液载固定液载带在固相带在固相基体上基体上 高效微高效微粒离子粒离子交换剂交换剂 具有不同孔具有不同孔径的多孔性径的多孔性凝胶凝胶多种不同性能的多种不同性能的配位体键联在固配位体键联在固相基体上相基体上流流动动相相不同极不同极性有机性有机溶剂溶剂不同极性不同极性有机溶剂有机溶剂和水和水不

47、同不同pHpH值的缓值的缓冲溶液冲溶液有机溶剂或有机溶剂或一定一定pHpH值的值的缓冲溶液缓冲溶液不同不同pHpH值的缓冲值的缓冲溶液，可加入改溶液，可加入改性剂性剂分分离离原原理理吸附与吸附与解吸解吸溶解与挥溶解与挥发发 可逆性可逆性的离子的离子交换交换多孔凝胶的多孔凝胶的渗透或过滤渗透或过滤具有锁匙结构络具有锁匙结构络合物的可逆性离合物的可逆性离解解高速逆流色谱高速逆流色谱 高速逆流色谱高速逆流色谱(high speed countercurrent chromatography，简称，简称HSCCC)是一种液是一种液-液色谱分离技液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附

48、，具术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。由于点。由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域。我国是继美国、日本之后最早开展逆流环境分析等领域。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家。色谱应用的国家。原理 1. 逆流色谱

49、是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）2. 通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相 3. 通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率 高速逆流色谱原理高速逆流色谱原理 特点特点 应用范围广，适应性好应用范围广，适应性好操作简便，容易掌握操作简便，容易掌握回收率高回收率高重现性好重现性好分离效率高，分离量较大分离效率高，分离量较大溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的离的关键所在，而样品中各组分的分配系数分配系数决定着这种溶剂系统决定着这种溶剂系统是

50、否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在数在0.2-50.2-5的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子最好大于或等于有足够的差异，分离因子最好大于或等于1.51.5；溶剂系统不会干；溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的

51、保留率不低于扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%50%，溶剂系统，溶剂系统的分层时间不超过的分层时间不超过3030秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷三类。经典的溶剂系统有正己烷- -甲醇甲醇- -水、正己烷水、正己烷- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲甲醇醇- -水、氯仿水、氯仿- -甲醇甲醇-

52、 -水和正丁醇水和正丁醇- -甲醇甲醇- -水等。在实验中，应根据水等。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的实际情况，总结分析并参照相关的专著专著及及文献文献，从所需分离的物，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统。合适的溶剂系统。 影响因素影响因素 1.1.固定相固定相的的保留值保留值 在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重在逆流色谱中，留在管中固

53、定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，高保留量将会大大改进峰要因素，高保留量将会大大改进峰分离度分离度。 2.2.转速的影响转速的影响 螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比，也就螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比，也就是对固定相的保留值的影响很大，从而影响了分离效果。是对固定相的保留值的影响很大，从而影响了分离效果。3.3.流速的影响流速的影响 流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，固定相流失加重，但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对固定相流失加重，但流速过慢会导致分离时间过

54、长，从而造成对溶剂的浪费。溶剂的浪费。 4.4.温度温度的影响的影响 温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低的保留值，但一般温度不可能提留值，而相反降低温度则得到低的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用的都是有机溶剂，高太多，因为所用的都是有机溶剂，沸点沸点很低。很低。5.5.相联检测技术相联检测技术 应用领域应用领域 （ 1 ）天然产物已知有效成分的分离纯化）天然产物已知有效成分的分离纯化 （ 2 ）化学合成物质的分离纯化）化学合成物质的分离纯化 （ 3 ）中药一类、五类新药的开发

55、）中药一类、五类新药的开发 （ 4 ）中药指纹图谱和质量控制研究）中药指纹图谱和质量控制研究 （ 5 ）抗生素的分离纯化）抗生素的分离纯化 （ 6 ）天然产物未知有效成分的分离纯化（新化合物开）天然产物未知有效成分的分离纯化（新化合物开发）发） （ 7 ）海洋生物活性成分的分离纯化）海洋生物活性成分的分离纯化 （ 8 ）放射性同位素分离）放射性同位素分离 （ 9 ）多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手性分离等）多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手性分离等 高效液相色谱的选择高效液相色谱的选择 首先必须尽可能多的首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种

56、色谱方法的主要特点及其应用范围各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。学结构等物理、化学性质。一、相对分子质量一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在对于相对分子质量较低（一般在200200以下），挥发性比较以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在相对分子质量在20

57、020020002000的化合物，可用液固吸附、液的化合物，可用液固吸附、液- -液分液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于配和离子交换色谱法。相对分子质量高于20002000，则可用空间排，则可用空间排阻色谱法。阻色谱法。二、溶解度二、溶解度 水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液可用液- -固色谱法。固色谱法。三、化学结构三、化

58、学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱

59、法。色谱分离条件选择色谱分离条件选择（一）（一） 减小柱内展宽，提高柱效减小柱内展宽，提高柱效固定相：粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质固定相：粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力；改进结构，尽可能采用大孔径和浅孔道的表面多阻力；改进结构，尽可能采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。流动相：选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中流动相：选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中的扩散系数的扩散系数Dm，减少传质阻力。减少传质阻力。流速：从流速：从H-u曲线可知，曲线可知，HPLC的最佳

60、流速在流速很小处，的最佳流速在流速很小处，减少流速有利于提高柱效，但在实践中为加快分析速度，减少流速有利于提高柱效，但在实践中为加快分析速度，常采用比最佳流速高数倍的流速。常采用比最佳流速高数倍的流速。柱温：适当提高柱温，可降低流动相粘度，减少传质阻力，柱温：适当提高柱温，可降低流动相粘度，减少传质阻力，但柱温升高将使分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，一但柱温升高将使分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，一般在室温下进行。般在室温下进行。（二）柱外展宽（二）柱外展宽 柱外谱带展宽又称柱外谱带展宽又称“柱外效应柱外效应”，系指从进样点到检测，系指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的