流式细胞仪原理及应用优秀课件

1、1流式细胞仪流式细胞仪FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER原理及应用原理及应用2 基本原理基本原理n光源u488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光n流路u流动室(flow cell)F鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS 无颗粒，无荧光本底 无菌，稳定的pHF样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/mln放大部分u光电倍增管PMT HVu放大电路 GAIN 增益F线性：LINF对数：LOGn统计：计算机3FLOW CELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath flu

2、id4FLOW CYTOMETRY(FCM)PMTAMPcomputerLINLOGLASERSAMPLESIGNAL5滤片滤片n带通滤片 BAND PASS (BP)u只允许某些波长的光通过n二向色性滤片 DICHROIC FILTERu一定波长以上通过，该波长以下折射630 nm BandPass FilterTransmitted LightWhite Light Source620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected lightTransmitted LightLight Source6PMTPMTPMTPMT

3、4DichroicFiltersBandpassFiltersFlow Cytometry PrincipleLaser 1234Flow cell7OPTICS8信号信号n荧光信号uFL1，FL2，FL3，FL4u线性，对数n散射光信号u前向散射光(FS)：细胞大小u侧向散射光(SS)：结构复杂程度9荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)10常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488

4、675 免疫荧光 深红PI 488 620 DNA染色 橙红11EPICS XL 流式细胞分析仪流式细胞分析仪12BECKMANCOULTERBECKMANCOULTERFLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER-细胞分析领域中的细胞分析领域中的CTCT实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析13细胞的特征与细胞功能n不同细胞的形态学特征n不同细胞的蛋白表达n其它细胞功能特征14CD # = cluster designation number1590 Degree Scatter0 200 400 600 8001000Forward S

5、catter0 200 400 600 8001000 815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionForward Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale16Log FITC 1000 100 10 1 110.1Count 30 700 15017Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 1001000Log PE Fluorescence (CD4).1 1 10 100123445%2%26% 双参数直方图双

6、参数直方图DOT PLOT27%18CD分子(Cluster of differentiation) -人类白细胞分化抗原1982年巴黎首届国际学术会议确定CD命名法已有200多个分化抗原群被鉴定和命名已得到WHO有关管理机关批准 19CD抗原及其相关细胞群抗原及其相关细胞群n 细胞群 CD抗原 n T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38n B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75n 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35n NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94n 血小板

7、 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 n 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97n 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-fn 内皮细胞 CD105 CD106 CD109n细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD12620212223242526HLA-B27:强直性脊柱炎相关标志CD23: 与变态反应严重程度呈正相关275例正常人CD4,CD8计数编 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8号 *109/L *100% *109/L

8、 *100% *109/L *100% *109/L 1 8.1 33.1 2681 38.3 1027 25.4 680 1.51 2 6.7 35.0 2345 43.2 1014 26.0 609 1.66 3 8.0 36.5 2920 38.0 1110 27.0 788 1.41 4 5.4 36.0 1944 43.5 846 22.0 428 1.98 5 5.4 34.1 1841 46.5 856 25.5 469 1.82 288例HIV/AIDS患者CD4,CD8计数编 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8号 *109/

9、L *100% *109/L *100% *109/L *100% *109/L 1 3.9 44.5 1736 34.9 606 48.0 833 0.73 2 1.8 32.0 576 4.3 25 61.8 356 0.07 3 3.6 48.3 1739 16.4 285 58.6 1019 0.28 4 3.1 36.2 1122 17.4 195 59.2 644 0.29 5 5.1 39.9 2035 2.9 60 74.7 1520 0.11 6 4.7 35.8 1683 23.8 401 35.6 599 0.67 7 4.0 18.0 720 10.3 74 43.3

10、312 0.24 8 4.6 60.1 2765 19.3 534 58.6 1620 0.23 298例HIV/AIDS患者临床情况编 性 测出抗HIV 目前的 诊断 临 床 情 况 号 别 阳性的年龄 年龄 1 女 30 30 HIV感染 无临床症状 2 男 34 35 AIDS TB,PCP,面神经麻痹,HZV, 隐球菌脑膜炎 3 女 30 34 HIV感染 无临床症状 4 女 23 26 HIV感染 乏力,体力差 5 男 32 33 AIDS TB,PCP 6 女 62 63 HIV感染 无临床症状 7 男 29 30 AIDS PCP 8 男 31 35 HIV感染 无临床症状 30

11、3132亚亚型型常常 表表 达达 抗抗 原原M0CD11b CD13或或CD33M1CD13 CD15 CD33 CD34 HLA-DR CD56 CD19M2CD11b CD13 CD15 CD33 CD34M3CD11b CD13 CD15 CD33 CD34M4CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34M5CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34M6血血型型糖糖蛋蛋白白A CD13 CD33 CD34M7CD41 CD61 CD13 CD33 CD34 因因子子相相关关抗抗原原33AML与ALL免疫表型 CD19 CD7 CD33 C

12、D13 HLA-DR TdTB-ALL + - - - + +/-T-ALL - + - - -/+ +AML - -/+ + + +/- - 34T-ALL表型特征 CD7 CD5 CD2 CD3 CD4 CD8 CD1a I + 90% 75% - - - -II + + + 25% 90% 90% +III + + + + +/- +/- - 35非T-ALL亚型 HLA-DR CD19 CD10 CD20 Cyu smIg Ig重排I + - - - - - -II + + - - - - +III + + + - - - + IV + + + + - - +V + + + + + -

13、 + VI + + - + - - + 36AML免疫表型 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7HLA-DR + + - + + +/- +/-CD34 + +/- - +/- +/- - +/-CD33 + + + + + +/- +/- CD13 +/- + + + + + +/- CD11b - + +/- + + - / CD15 - + +/- + + +/- / CD14 - +/- - + + - - GPA - - - - - + - GP - - - - - - + 373839成人急性白血病成人急性白血病P-gpP-gp表达的临床意义表达的临床意义 P-gp+ P-gp

14、+ P-gp-P-gp- 缓解率（CR） 20.5% 78.5%AMLAML 6个月复发率 66.7 % 8.7% 151 平均无病生存期 5M 13M 缓解率（CR） 66.7% 80.0%ALL ALL 6个月复发率 50.0 % 9.5% 47 平均无病生存期 4M 13M李建勇 Clin J Oncol 1998,4:30240 成人成人ALLALL多药耐药多药耐药P-gpP-gp与形成学分型的关系与形成学分型的关系 分型 例数 P-gp+ P-gp- P-pg阳性率 L1 25 3 22 12% L2 40 10 30 25% L3 3 1 2 33.3%P0.05 华东：中华血液学

15、杂志，1998，19：37141P-gpP-gp表达与表达与ALLALL免疫分型的关系免疫分型的关系免疫分型 例数 P-gp阳性例数 阳性率(%) B 38 8 21.1 T 10 1 10.0 T/B 4 2 50.0 难分类 4 2 50.0 My- 40 4 10.0 My+ 16 9 56.3 My+ALL My+ALL 的的P-gpP-gp阳性率明显增高阳性率明显增高42AMLAML中免疫表型与中免疫表型与P- gpP- gp表达的关系表达的关系成人：成人： P-gp的表达与CD7、CD14、CD42b、CD61、 CD34 等高度相关。老年人：老年人： P-gp的表达与CD14、C

16、D42b、CD61有相关性 P-gp的表达与CD34高度相关。 43444.血液病的其他应用AA，PNH鉴别诊断自身抗体检测 PAIgG, PAIgM, PAIgA RBC抗体 粒细胞抗体45PNH红细胞表面CD59表达4647 癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的表达及与预后的关系(癌前病变,恶性肿瘤预后评价)细胞增殖能力研究细胞增殖能力研究48490 200 400 600 8001000DNA contentCountNormal Cell Cycle 500 200 400 600 8001000PI FluorescenceCounts0 75 150 225 300DNA Analysi

17、s510 200 400 600 8001000PI FluorescenceCounts0 75 150 225 300DNA Analysis5253DNA倍倍体体DNA指指数数(DI)意意义义(染染色色体体数数)正正二二倍倍体体 (2n, Diploid)1.0046条条染染色色体体亚亚二二倍倍体体 (Haploid)0.5023条条染染色色体体四四倍倍体体 (Teraploid)2.0092条条染染色色体体低低倍倍体体 (Hypoploid)1.01.046条条染染色色体体54淋巴瘤组织学分级与DNA倍体及S期细胞关系Histology DNA Analysis S 期比值期比值(%)

18、Low -grade Diploid 15Intermediate-grade Frequently Aneuploid 5 15High-grade Frequently Diploid 1555异倍体癌前病例病变结果组织类别 异倍体(例数) 癌变例数 组织学分级 1 2 3鼻咽 13 7 0 1 6口腔 7 4 0 0 4胃 10 3 0 0 3宫内膜 9 6 0 1 5宫颈 6 2 0 0 2总计 45 22 2 20 56各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(1)组织类别 不典型增 例数 DNA倍体(例数) 生分级 二倍体 异倍体 鼻咽粘膜 1 11 11 0 2 28 23 5 3

19、 13 5 8口腔粘膜 1 10 10 0 2 6 6 0 3 19 12 7 57各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(2)组织类别 不典型增 例数 DNA倍体(例数) 生分级 二倍体 异倍体胃粘膜 1 18 18 0 2 14 13 1 3 14 6 8宫内膜 1 10 10 0 2 14 13 1 3 16 8 8宫颈粘膜 1 9 9 0 2 16 12 4 3 5 3 2 58596061626364 活化血小板的概念活化血小板的概念循环血液中处于静息状态的血小板受到生物或物理因子刺激后,使血小板胞浆内颗粒膜糖蛋白释放与质膜融合,血小板膜表面糖蛋白发生数量重排和构象变化而成为活化血小

20、板65活化血小板的功能活化血小板的功能参与血栓形成与止血参与炎症和免疫反应参与肿瘤的转移66血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究： 1.脑缺血患者急性期血小板CD62p、CD63测定2.缺血性脑血管患者CD62p、CD54、CD49d测定3.缺血性脑血管患者CD62p、TSP、CD54测定676869 应用应用FCMFCM曾开展过的一此基础研究曾开展过的一此基础研究：胃癌及癌旁组织胃癌及癌旁组织DNADNA、细胞凋亡、细胞凋亡、P- gp P- gp 、粘附分子检测的临粘附分子检测的临床意义床意义哮喘患者氨茶碱诱导细胞凋亡的实验研究哮喘患者氨茶碱诱导

21、细胞凋亡的实验研究 NONO与造血干细胞增殖活性关系的研究与造血干细胞增殖活性关系的研究中药中药 “清心饮清心饮”拆方治疗病毒性心肌炎机制的实验研究拆方治疗病毒性心肌炎机制的实验研究中药治疗强直性脊柱炎的机理研究中药治疗强直性脊柱炎的机理研究氨氯地平治疗高血压的机理研究氨氯地平治疗高血压的机理研究葛根素对心肌细胞保护机制的实验研究葛根素对心肌细胞保护机制的实验研究心脏移植后免疫排异反应监测的研究心脏移植后免疫排异反应监测的研究70细胞凋亡研究n亚二倍体nCD95(Fas, APO1)nAPO2.7nANNEXIN V-PIn断裂点掺入71细胞周期分析细胞周期分析-异倍体与凋亡峰异倍体与凋亡峰73凋亡检测 Annexin V-PI双标记GATESSAMPLE NAME : 1SAMPLE NUMBER: SAMPLE DATE: 10Sep99 SAMPLE TIME: 16:43:35 17Sep99 at 09:51:01Page 1SSC 60 50 40 30 20 100FS 60 50 40 30 20 100ACLG: 12835141566scaleGATESSAMPLE NAME : 1SAMPLE NUMBER: SAMPLE DATE: