实验13 经典免疫技术

1、实验原理实验原理1 1、直接凝集反应（原理）、直接凝集反应（原理）将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O O型）和型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅

2、酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。比直接凝集反应高得多。+（二）材（二）材 料料（三）方（三）方 法（法（细菌菌型测定）1.1.取一块清洁取一块清洁载玻片载玻片，用记号笔划上，用记号笔划上记号记号，在一侧滴加，在一侧滴加标标准的诊断血清准的诊断血清一滴一滴, ,另一侧滴加另一

3、侧滴加一滴生理盐水一滴生理盐水。2.2.用接种环无菌操作取适量的待测细菌用接种环无菌操作取适量的待测细菌, ,分别与标准诊断分别与标准诊断血清和生理盐水混均。血清和生理盐水混均。3.3.静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微镜观察。微镜观察。注意事项：注意事项：（1 1）生理盐水、诊断血清要适量；）生理盐水、诊断血清要适量；（2 2）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后放）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后放入消毒缸内；入消毒缸内；（3 3）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与生）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；

4、待检菌与生理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否则影响结理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否则影响结果观察。果观察。（四）结果判断二 、沉淀反应（双向琼脂扩散试验） 又称双向琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质又称双向琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀，可观察到沉淀线。相遇，比例合适时形成沉淀，可观察到沉淀线。 沉淀线的特征与位置取决于抗原分子的大沉淀线的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构

5、、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀线。存在多种体系时，会出现多条沉淀线。 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。范围较广。（二）材料（二）材料玻片、琼脂糖、抗原、抗体（玻片、琼脂糖、抗原、抗体（0；1:2； 1:4； 1:8； 1:16）、微量加样器、滴管、湿盒、）、微量加样器、滴管、湿盒、水浴箱等。水浴箱等。（三） 操作步骤每孔加入每孔加入抗原抗原/ /抗体抗体10l10l注意事项注意事项 （1）打

6、孔时，不要将琼脂划破； （2）加样时，不要溢出孔外； （3）加样用的吸管不要混用。Ag01/11/21/41/81/16AbAbAbAbAb（四）（四） 结果记录结果记录用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检测标本中未用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检测标本中未知抗原或抗体的技术。知抗原或抗体的技术。（一）原理（一）原理以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物的显色（胶体金标记

7、物的显色（20nm20nm的胶体金颗粒呈砖红的胶体金颗粒呈砖红色）达到检测目的。色）达到检测目的。 根据检测装置的不同，可分为胶体金斑点渗滤试根据检测装置的不同，可分为胶体金斑点渗滤试验和胶体金斑点免疫层析试验。验和胶体金斑点免疫层析试验。胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验将各种反应试剂将各种反应试剂( (抗体抗体) )附着在硝酸纤维素膜条上，检测时附着在硝酸纤维素膜条上，检测时将待检标本加在膜条的一端，使膜条上的胶体金标记抗体将待检标本加在膜条的一端，使膜条上的胶体金标记抗体溶解后，与标本中的待测物质反应形成溶解后，与标本中的待测物质反应形成ICIC，并通过毛细管，并通过毛细管作用

8、在膜条上渗滤、移行，再与膜上另一种抗体反应，再作用在膜条上渗滤、移行，再与膜上另一种抗体反应，再后被截留、聚集在膜条的一定区域，形成有颜色的反应条后被截留、聚集在膜条的一定区域，形成有颜色的反应条带。带。临床上常用的有胶体金早孕诊断试剂条临床上常用的有胶体金早孕诊断试剂条 用鼠抗用鼠抗-HCG-HCG（人绒毛膜促性腺激素人绒毛膜促性腺激素）单克隆抗体）单克隆抗体和兔抗鼠和兔抗鼠1gG1gG多克隆抗体分别固相硝酸纤维膜和胶体金标多克隆抗体分别固相硝酸纤维膜和胶体金标记的抗记的抗-HCG-HCG单克隆抗体及其他试剂制成，应用层析式双单克隆抗体及其他试剂制成，应用层析式双抗体夹心法的原理检测尿液中抗

9、体夹心法的原理检测尿液中HCGHCG，用于妊娠早期辅助诊，用于妊娠早期辅助诊断。断。C区区T区区吸水区吸水区 抗小鼠抗小鼠IgG抗体抗体(固定固定)抗抗-HCG抗体抗体(固定固定)胶体金胶体金-抗抗 -HCG抗体抗体(小鼠小鼠IgG,游离游离)下端浸入尿液下端浸入尿液试纸条试纸条HCGC区区T区区抗抗-HCG + HCG + 胶体金胶体金-抗抗-HCGT区红线区红线C区红线区红线抗小鼠抗小鼠IgG + 胶体金胶体金-抗抗-HCG阳性阳性阴性阴性无效无效HCG(+) HCG(-)结论结论:实验结果实验结果(3(3种可能种可能) )（五）结果分析（五）结果分析人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）是受孕妇女体）是受孕妇女体内产生的一种糖蛋白类激素，在受孕妇女内产生的一种糖蛋白类激素，在受孕妇女血液和尿液中大量存在。卵子受精后第血液和尿液中大量存在。卵子受精后第6 6天天开始分泌开始分泌HCGHCG，一般，一般1111天后可以测出天后可以测出, ,早期早期妊娠时妊娠时H