实验十二 DNA连接与转化ppt课件

1、实验十二实验十二 DNA的衔接与转化的衔接与转化1.分子的体外衔接2的转化及转化子的挑选一实验目的及背景一实验目的及背景 当我们曾经获得目的基因片段，选择好适当的克隆或表达，转化质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进展的就是片段之间的体外衔接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达如现代基因工程药物的消费，还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研讨中。1、分子的体外衔接 分子的体外衔接就是在一定条件下， 由衔接酶催化两个双链片段组邻的端磷酸与端羟基之间构成磷酸酸脂键的生物化学过程， 分子的衔接是在酶切反响获得同种酶互补序列根底上进展的。衔接反响中值

2、得留意的几个问题： 1.衔接酶 常用的衔接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的衔接酶 (2)来自噬菌体的衔接酶。 二者的作用机理类似。衔接酶作用机制 衔接酶作用分三步： 衔接酶与辅助因子构成酶复合物。 酶复合物结合到具有磷酸基和羟基切口的上，使腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.2.衔接反响的温度 衔接酶的最适反响温度为， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是过夜。3. DNA的平未端和粘性末端 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因此衔接反响中就有平未端衔接和粘性末端衔接。 二者衔接效率不同。 粘性末端效率高，因此在底物浓度，酶浓度选择上是有差别的，4.碱

3、性磷酸酶处置质粒载体 为了提高衔接效率，普通采取提高的浓度，添加重组子比例。这样就会出现自生衔接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处置，除去其末端的磷酸基，防止环化， 经过接反响后构成的缺口可在转化细胞后得以修复。见以下图。5.衔接反响的检测 衔接反响胜利与否，最后的检测要经过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的挑选来确定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。 二、实验试剂二、实验试剂 纯化后的酶切质粒载体和目的基因。纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 衔接酶衔接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇二硫苄糖醇 500l/m

4、l BSA 衔接酶衔接酶 5mM ATP三实验方法三实验方法分子的体外衔接在无菌Eppendorf管中参与以下溶液：a. 0.1g质粒载体，倍分子的外源。b. 加无菌水至7.5l，于加温分钟使重新退火的粘端解链， 将混合物冷却到。c. 参与：衔接酶buffer 1l衔接酶 0.1Weiss5mM ATP 1l盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心秒。下过夜衔接反响。反响终了后于保管。四结果与分析四结果与分析 电泳检查衔接结果 如何判别衔接效果的胜利性？问题与讨论： 简述衔接酶作用机理。 简述一个完好外源的克隆过程。 衔接反响中应留意些什么问题及如何提高衔接效率。2的转化及转化子的挑选的转化及转化

5、子的挑选 一实验目的及背景一实验目的及背景 体外经过基因工程手段所构建的含目的基因的重组体外经过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和挑选技术，质粒，选用转化和挑选技术， 可获得含重组的阳性可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，可在生物体系中大克隆。在此阳性克隆中，可在生物体系中大量扩增，繁衍，量扩增，繁衍， 保管以及表达目的基因的产物，这保管以及表达目的基因的产物，这是体外扩增所不能替代的。配合是体外扩增所不能替代的。配合重组技术，所获得的，不同目的需求的阳性菌株重组技术，所获得的，不同目的需求的阳性菌株已广泛运用于科研，医药消费和生物发酵等领域。已广泛运用于科研，医药消费和

6、生物发酵等领域。本实验由二个方面组成: 1. 质粒转化大肠杆菌。 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转化效率可达转化子/g DNA。 获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理形状。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两种假说： 部分原生质体化假说感受态细胞的外表构成一种能接受的酶位点， 使分子能进入细胞。制备感受态细胞 如今制备感受态细胞通常用CaCl2处置，在低温中与外来分子相混合. 分子转化分以下几步: 吸附双链分子吸附于受体菌外表； 转入双链分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； 自稳外源质

7、粒分子在细胞内复制成双链； 表达一供体基因伴随复制子同时复制，分裂， 转录翻译。2.重组子的挑选 这和受体菌：质粒的选择相关， 原那么上要留意： 受体菌必需是限制与修饰系统缺陷的菌株； 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原那么而定。 重组子的挑选方法常用的有两种方法：抗生素挑选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因如氨苄青霉素， 卡拉霉素等这样只需转化子才干在含该抗生素的培育基上长出。本实验利用抗生挑选转化子。互补法 如今运用的许多载体如系列有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因lacZ的调控序列和头个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌那么含编码半乳糖

8、苷酶端的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有半乳糖苷酶表达， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷x-gal培育基中构成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而呵斥插入失活，而使lacZ基因不表达而构成白色菌斑。 经过颜色不同而区分重组子和非重组子。二、实验试剂二、实验试剂 培育基 质粒含Amp抗生基因，受体菌 CaCl2 0.1M Amp 三实验方法三实验方法一、感受态细胞制备将宿主菌在琼脂培育基平板上划线，培育小时。挑取单菌落转入 培育基锥瓶中，振荡过夜。从中取菌液转入 培育基中振荡培育小时， 测达。培育物于冰上分钟。转入离心管，于下离心分钟。弃上清，倒置离心管分钟，流尽剩余残液然后参与10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上分钟。4,000rpm 4离心分钟，弃上清。参与2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于过夜。二、转化 在1.5ml Eppendorf管中参与l感受态细胞和l 40ng DNA溶液， 温暖混匀，于冰上分钟。 于水浴秒。 冰浴分钟。