哺乳动物细胞表达重组蛋白

1、1会计学哺乳动物细胞表达重组蛋白哺乳动物细胞表达重组蛋白原核表达系统酵母表达系统植物表达系统昆虫表达系统 哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高， 与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物 学功能 我国从2000年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较 晚，基础较差，但经过努力实现了该项技术的突破。 (1) 细胞培养时间延长，由过去的7天延长至21天； (2) 细胞密度增加， 过去：1-2X106细胞毫升， 现在：1-1.5X107细胞毫升； (3) 产量增加， 过去：1020pg重组蛋白细胞天， 50一100mg重组蛋白升， 现在：50-90pg重组蛋白细胞天， 1-5g重组蛋白升。 人工构建的哺乳动物

2、细胞表达载体为穿梭载体，含： 原核DNA序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备。 转录相关元件：哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件，以及终止子和加polyA信号序列。 翻译相关元件：有效的mRNA翻译信号 其它：视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。 转录终止序列 真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基因3端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。SV40的早期和晚期PolyA.分泌表达载体 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以下条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征， 便于大规模

3、培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失， 易于长期保存。 合适的标记：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。 中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞人胚肾细胞（ HEK293 ）的优势贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养。在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度较低的培养基中。具有很高的质粒转染效率和对保持外

4、源基因的高稳定性 为了减少成本和节约时问，近年来发展了大规模悬浮培养细胞瞬时转染技术 常用的商业化的离了脂质转染试剂，转染效率很高，但价格不菲 目前有两种试剂(磷酸钙和聚乙烯亚胺)可用以满足大规模培养瞬时表达利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本抑制细胞凋亡，延长培养周期原核表达系统酵母表达系统植物表达系统昆虫表达系统 哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高， 与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物 学功能 人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含： 原核DNA序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备。 转录相关元件：哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件，以及终止子和加polyA信号序列。 翻译相关元件：有效的mRNA翻译信号 其它：视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。 转录终止序列 真