核酸杂交技术学习教案

1、会计学1核酸杂交核酸杂交(zjio)技术技术第一页，共63页。第1页/共62页第二页，共63页。第四节第四节 影响杂交信号影响杂交信号(xnho)(xnho)检测的因素检测的因素一、探针的选择一、探针的选择二、探针的标记方法二、探针的标记方法三、探针的浓度三、探针的浓度四、杂交率四、杂交率五、杂交温度五、杂交温度六、杂交的严格谨性六、杂交的严格谨性七、杂交反应时间七、杂交反应时间八、杂交促进剂八、杂交促进剂第2页/共62页第三页，共63页。第3页/共62页第四页，共63页。变性变性(binxng) (binxng) 退火退火 复性复性第4页/共62页第五页，共63页。核酸(h sun)分子杂交

2、的基本原理1 1、变性、变性(binxng)(binxng)（denaturationdenaturation）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。则线团，双链解链成为单链。 第5页/共62页第六页，共63页。影响影响TmTm的因素：的因素： （1 1）DNADNA碱基的组成碱基的组成 G-C G-C含量越多含量越多 Tm Tm值越高值越高 A-T A-T含量越多含量越多 Tm Tm值越低值越低 （2 2）溶液的离子强度）溶液的离子强度 低离子强度低离子强度 Tm Tm值越低值越低

3、 高离子强度高离子强度 Tm Tm值越高值越高 （3 3）pHpH值值 pH pH值值5-9 Tm5-9 Tm值变化不值变化不明显明显 pH11 pH11 不利于氢键不利于氢键(qn jin)(qn jin)形成形成 （4 4）变性剂）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键干扰碱基堆积力和氢键(qn (qn jin)jin)的形成的形成第6页/共62页第七页，共63页。3.3.复性复性 变性变性(binxng)DNA(binxng)DNA经过一定处理重新形成双螺旋经过一定处理重新形成双螺旋的过程。的过程。影响复性速度的因素：影响复性速度的因素： DNA DNA浓度浓度 DNA DNA片段的大小片段的大小

4、 DNA DNA片段复杂性片段复杂性 合适的复性温度合适的复性温度 适当适当(shdng)(shdng)的离子的离子强度强度第7页/共62页第八页，共63页。第8页/共62页第九页，共63页。第9页/共62页第十页，共63页。探针探针(tn (tn zhn)zhn)的种类的种类寡核苷酸探针寡核苷酸探针(tn (tn zhn)zhn)基因组基因组DNADNA探针探针(tn (tn zhn)zhn)cDNAcDNA探针探针RNARNA探针探针DNADNA探针探针（一一）常用探针的种类）常用探针的种类第10页/共62页第十一页，共63页。三大优点：三大优点： 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁

5、殖，这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便；制备方法简便； DNA DNA探针相对不易探针相对不易(b y)(b y)被降解，一般被降解，一般DNADNA酶活酶活性能有效地被抑制；性能有效地被抑制； DNA DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、如缺口平移法、随机引物法、PCRPCR标记法等，能用于放标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。射性核素和非放射性物质标记。 第11页/共62页第十二页，共63页。 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，

6、未杂交探针可用较少，未杂交探针可用RNase RNase 降解，减少本底降解，减少本底(bn d)(bn d)的干扰。的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂缺点：易降解，标记方法复杂 。第12页/共62页第十三页，共63页。寡核苷酸探针一般由寡核苷酸探针一般由17175050个核苷酸组成。个核苷酸组成。优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需优化杂交优化杂交(zjio)(zjio)和洗脱条件以保证寡核苷酸和洗脱条件以保证寡核苷酸探针杂交探针杂交(zjio)(zjio)的特异

7、性。的特异性。第13页/共62页第十四页，共63页。1.DNA和和RNA探针探针 DNA探针通常探针通常(tngchng)为为400500个碱基个碱基2. 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性第14页/共62页第十五页，共63页。1. 1. 探针标记探针标记(bioj)(bioj)物的选择物的选择（1 1）放射性标记）放射性标记(bioj)(bioj)（2 2）非放射性标记）非放射性标记(bioj)(bioj)根据标记根据标记(bioj)(bioj)物掺入情况可分为均匀标物掺入情况可分为均匀标记记(bioj)(bioj)和末端标记和

8、末端标记(bioj)(bioj)探针。探针。第15页/共62页第十六页，共63页。 优点优点缺点缺点放射性探放射性探针针可以准确定量；灵可以准确定量；灵敏度高；本底低；敏度高；本底低；易于除去旧探针易于除去旧探针, ,重新杂交新探针重新杂交新探针短半衰期的探针需临用短半衰期的探针需临用前制备；放射性递减使前制备；放射性递减使探针降解；放射性物质探针降解；放射性物质对人体有害；费用贵对人体有害；费用贵非放射性非放射性探针探针对人体危害小；稳对人体危害小；稳定，可供长时间内定，可供长时间内持续使用；检测过持续使用；检测过程快；可同时进行程快；可同时进行不同标记探针的杂不同标记探针的杂交；本底较低交

9、；本底较低灵敏度不如放射性探针；灵敏度不如放射性探针；杂交条件受报告基团的杂交条件受报告基团的限制；重新杂交新探针限制；重新杂交新探针比较困难比较困难第16页/共62页第十七页，共63页。制备制备(zhbi)(zhbi)探针步骤：探针步骤：探针标记探针标记清除未标记的核酸探针清除未标记的核酸探针检测探针标记效率检测探针标记效率 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法(1) DNA(1) DNA切口平移标记法切口平移标记法(2) DNA(2) DNA随机引物标记法随机引物标记法(3) DNA(3) DNA的末端标记的末端标记(7) RNA(7) RNA探针的标记探针的标记(4) cDNA(4) c

10、DNA探针的标记探针的标记(5) (5) 寡核苷酸探针的标记寡核苷酸探针的标记(6) (6) 单链单链DNADNA探针的标记探针的标记第17页/共62页第十八页，共63页。随机引物：含有各种可随机引物：含有各种可能排列能排列(pili)(pili)顺序的顺序的寡核苷酸片段的混合物寡核苷酸片段的混合物。DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段：保片段：保留留(boli)53DNA(boli)53DNA聚合聚合酶活性酶活性, ,弱弱3535外切酶活外切酶活性，无性，无5353外切酶活性外切酶活性。（1 1）DNADNA随机随机(su j)(su j)引物标记引物标记第18页/共62页第

11、十九页，共63页。5 3 3 5 32P-部分标记部分标记(bioj)的单的单链链DNA片段片段切口切口原始原始位置位置切口切口最终最终位置位置32P-标记的标记的DNADNA聚合酶聚合酶I-32P-dCTP变性变性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNADNA酶酶：在双链：在双链DNADNA上上随机随机(su j)(su j)打开若干打开若干个单链缺口，产生个单链缺口，产生3-3-OHOH端。端。大肠杆菌大肠杆菌(d chn (d chn n jn)DNAn jn)DNA聚合酶聚合酶：53DNA53DNA聚合酶聚合酶活性；活性；53 53 外切外切核酸酶活性。核酸酶活性。（

12、2 2）DNADNA切口平移标记切口平移标记第19页/共62页第二十页，共63页。 条件条件(tiojin)(tiojin)是有是有5-OH5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链链DNADNA需用碱性磷酸酶切除需用碱性磷酸酶切除5-P5-P后再标记后再标记55p-HOp-HO-CpGpTpA3-CpGpTpA355HO-HO-CpGpTpA3CpGpTpA3T4T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶(jmi)(jmi)-3232P-ATPP-ATP553232p p-O-CpGpTpA3-O-CpGpTpA33737，反应，反应(fnyng)10min,

13、-32P-ATP (fnyng)10min, -32P-ATP 需需150 ci/150 ci/反应反应(fnyng)(fnyng)1) DNA1) DNA的的55末端标记末端标记碱性磷酸酶碱性磷酸酶(3) DNA(3) DNA的末端标记的末端标记第20页/共62页第二十一页，共63页。5335完整完整(wnzhng)(wnzhng)双双链链DNADNA限制性内切酶限制性内切酶5335-3232P-dNTPP-dNTP其他其他(qt)3 (qt)3 种种dNTPdNTPKlenow DNAKlenow DNA聚合酶聚合酶5335变性533555末端末端(m (m dun)dun)突出的突出的D

14、NADNA33末端标记的末端标记的DNADNA3232P-P-末端标记的末端标记的单链单链DNADNA探针探针2) DNA2) DNA的的33末端标记末端标记第21页/共62页第二十二页，共63页。（一）放射（一）放射(fngsh)性标记探针检测性标记探针检测1、放射、放射(fngsh)自显影自显影2、液体闪烁计数法、液体闪烁计数法（二）非放射（二）非放射(fngsh)性标记探针的杂交检测性标记探针的杂交检测1、酶促显色检测、酶促显色检测2、荧光检测、荧光检测3、化学发光检测、化学发光检测4、多探针检测、多探针检测第22页/共62页第二十三页，共63页。1. 1.放射自显影放射自显影 放射性杂

15、交的检测基于放射性核素释放的能放射性杂交的检测基于放射性核素释放的能量将照片纸感光的原理。量将照片纸感光的原理。用用32P32P标记杂交最常用标记杂交最常用(chn yn)(chn yn)的检的检测方法是放射自显影。测方法是放射自显影。第23页/共62页第二十四页，共63页。 液体闪烁计数法的工作原理是被测样品液体闪烁计数法的工作原理是被测样品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发态退激分子，当被激发的闪烁剂分子从激发态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射能量，经为稳态时，以荧光光子的形式辐射能量，经光电倍增管放大并被测量光电

16、倍增管放大并被测量(cling)，就可以，就可以实现对放射性核素的测定。实现对放射性核素的测定。第24页/共62页第二十五页，共63页。 1. 1.酶促显色检测酶促显色检测（1 1）直接检测）直接检测酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱后就可酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱后就可直接进行检测。直接进行检测。酶直接作用于显色的底物，产生颜色沉淀，显色沉淀酶直接作用于显色的底物，产生颜色沉淀，显色沉淀可用肉眼检测。可用肉眼检测。酶直接作用于化学发光的底物发光酶直接作用于化学发光的底物发光, , 发光的检测要依发光的检测要依赖于对蓝光敏感的赖于对蓝光敏感的X X胶片。胶片。这种检测法常用

17、于寡核苷酸探针杂交，这类杂交反应这种检测法常用于寡核苷酸探针杂交，这类杂交反应(fnyng)(fnyng)温度低。温度低。 第25页/共62页第二十六页，共63页。碱性磷酸酶显色碱性磷酸酶显色(xin s)(xin s)反应示意图反应示意图第26页/共62页第二十七页，共63页。HRPHRP酶显色酶显色(xin s)(xin s)反应示意图反应示意图(DAB)(TMB)第27页/共62页第二十八页，共63页。Dig：半抗原：半抗原(kngyun)，可通过抗原，可通过抗原(kngyun)抗体反应系统抗体反应系统与显色体系偶联与显色体系偶联Dig-DNADig-DNA探针探针(tn zhn) +

18、(tn zhn) + 抗抗DigDig抗体抗体- -碱碱性磷酸酶（或性磷酸酶（或辣根过氧化物辣根过氧化物酶）酶）+ + 底物底物（2）间接）间接(jin ji)检测检测 检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，就检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。第28页/共62页第二十九页，共63页。 荧光素：一类能在激发荧光素：一类能在激发(jf)(jf)光作用下发射出荧光的物质光作用下发射出荧光的物质 荧光显微镜观察、免疫组织化学法荧光显微镜观察、免疫组织化学法 2 2荧光荧光(ynggung)(ynggung

19、)检测检测 第29页/共62页第三十页，共63页。 3化学发光底物(d w) 辣根过氧化物酶催化辣根过氧化物酶催化(cu hu)的化学发光反应的化学发光反应第30页/共62页第三十一页，共63页。4 4多探针多探针(tn zhn)(tn zhn)检测检测 第31页/共62页第三十二页，共63页。 第二节第二节 经典的核酸分子杂交经典的核酸分子杂交(zjio)(zjio)技术技术第32页/共62页第三十三页，共63页。根据根据(gnj)(gnj)杂交核酸分子的种杂交核酸分子的种类类 DNA DNA与与DNADNA杂交杂交 DNA DNA与与RNARNA杂交杂交 RNA RNA与与RNARNA杂交

20、杂交根据杂交根据杂交(zjio)探针标记探针标记 同位素杂交同位素杂交(zjio) 非同位素杂交非同位素杂交(zjio)根据根据杂交介质杂交介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交 原位杂交原位杂交菌落杂交菌落杂交Southern印迹杂交印迹杂交Northern印迹杂交印迹杂交点杂交点杂交狭缝杂交狭缝杂交第33页/共62页第三十四页，共63页。第34页/共62页第三十五页，共63页。先将待测单链核酸样品结合到固相支持物（常用有硝先将待测单链核酸样品结合到固相支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行

21、杂交，放射自显影溶液中的已知序列的标记探针进行杂交，放射自显影(xin yng)(xin yng)分析杂交结果。分析杂交结果。第35页/共62页第三十六页，共63页。反向点杂交反向点杂交(zjio)(zjio)（reverse dot blot, RDBreverse dot blot, RDB）是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNADNA又互不干扰，又互不干扰， 故能一次性筛查出多种不同的故能一次性筛查出多种不同的序列。序列。特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好较较Northern blotNor

22、thern blot省去了电泳和毛细转膜过程省去了电泳和毛细转膜过程第36页/共62页第三十七页，共63页。 Southern印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。可用于基因组DNA的定性与定量分析(dnglingfnx)，重组质粒和噬菌体的分析等。第37页/共62页第三十八页，共63页。包括两个主要过程：包括两个主要过程：将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，

23、即印迹（印迹（blottingblotting）。）。固定于膜上的核酸与同位素标记固定于膜上的核酸与同位素标记(bioj)(bioj)的探针在的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。第38页/共62页第三十九页，共63页。SouthernSouthern印迹杂交的基本印迹杂交的基本(jbn)(jbn)步骤：步骤： 待测待测DNADNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化 酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离 凝胶中凝胶中DNADNA的变性和的变性和SouthernSouthern转移转移 探针的制备探针的制备(zhbi

24、)(zhbi) Southern Southern杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测第39页/共62页第四十页，共63页。限制性内切酶消化限制性内切酶消化酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离凝胶中凝胶中DNADNA的的NaOHNaOH变性变性凝胶中凝胶中DNADNA分离带分离带SouthernSouthern印迹印迹凝胶中凝胶中DNADNA带被带被转移到转移到NCNC膜上膜上标记探标记探针杂交针杂交探针杂交带曝光显影探针杂交带曝光显影第40页/共62页第四十一页，共63页。应用应用单基因遗传病的基因诊断单基因遗传病的基因诊断基因点突变的检测基因点突变的检测临床应用用于下列临床应

25、用用于下列(xili)(xili)疾病的产前诊断疾病的产前诊断 镰型细胞贫血镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良假肥大型肌营养不良 血友病血友病 慢性进行型舞蹈病慢性进行型舞蹈病第41页/共62页第四十二页，共63页。（三）（三）Northern印迹杂交印迹杂交Northern 印迹（印迹（Northern blot）杂）杂交是应用交是应用DNA探针检测特异探针检测特异mRNA的的另一种膜上印迹技术。另一种膜上印迹技术。此项技术的原理和过程与此项技术的原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子印迹基本相同，只是检测的

26、分子(fnz)是是RNA，可用来对组织或细胞中的，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。第42页/共62页第四十三页，共63页。1. RNA病毒病毒(bngd)的检测的检测2. 基因表达的检测基因表达的检测Northern印迹技术被认为是检测基因表达水平印迹技术被认为是检测基因表达水平的金标准。的金标准。 第43页/共62页第四十四页，共63页。 液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子互补配对形成杂交分子(fnz)的过程。的过

27、程。第44页/共62页第四十五页，共63页。 一种研究最早且操作简便的杂交类型。一种研究最早且操作简便的杂交类型。 原理和反应条件原理和反应条件(tiojin)与固相杂交基本相同，与固相杂交基本相同，仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应。液中进行反应。 液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困难，同源与异源的难，同源与异源的DNA分子在杂交的过程中会发生分子在杂交的过程中会发生竞争，使得杂交结果的分析十分困难。竞争，使得杂交结果的分析十分困难。 因此液相杂交应用较少因此液相杂交应用较少第

28、45页/共62页第四十六页，共63页。 应用核酸探针与组织或细胞中的核酸应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交(zjio)(zjio)体，然后应用组织细胞化学或免疫组体，然后应用组织细胞化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。表达的检测技术。 第46页/共62页第四十七页，共63页。第47页/共62页第四十八页，共63页。第48页/共62页第四十九页，共63页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)原位杂交原位杂交(FISH, Fluorescence (

29、FISH, Fluorescence in situ Hybridization)in situ Hybridization)利用荧光标记的探针与利用荧光标记的探针与待测标本的核酸进行原待测标本的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别下对荧光信号进行辨别(binbi)(binbi)和计数，从而和计数，从而对染色体或基因异常的对染色体或基因异常的细胞、组织标本进行检细胞、组织标本进行检测和诊断测和诊断 第49页/共62页第五十页，共63页。杂交类型杂交类型检测目的及范围检测目的及范围SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至检测经凝

30、胶电泳分离且转移至膜上的膜上的DNADNA分子分子NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的膜上的RNARNA分子分子反向斑点杂交反向斑点杂交检测样品中的检测样品中的DNADNA或或RNARNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织上的检测细胞或组织上的DNADNA或或RNARNA分子分子第50页/共62页第五十一页，共63页。 第四节第四节 影响杂交信号检测影响杂交信号检测(jin c)的因的因素素第51页/共62页第五十二页，共63页。 在核酸杂交在核酸杂交(zjio)反应中影响杂交反应中影响杂交(zjio)体形成因素较多，主

31、要有探针的选择、体形成因素较多，主要有探针的选择、探针的标记方法、探针的浓度、杂交探针的标记方法、探针的浓度、杂交(zjio)率、杂交率、杂交(zjio)最适温度、杂交最适温度、杂交(zjio)的严的严谨性、杂交谨性、杂交(zjio)反应时间及杂交反应时间及杂交(zjio)促促进剂等。进剂等。第52页/共62页第五十三页，共63页。在大多数情况下，可以选择克隆的在大多数情况下，可以选择克隆的DNADNA或或cDNAcDNA双链探针。双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它但是在有些情况下，必须选用其它(qt)(qt)类型的探针如寡核苷酸探针和类型的探针如寡核苷酸探针和RNARNA探针。探针。第

32、53页/共62页第五十四页，共63页。探针的标记方法探针的标记方法(fngf)很多，选择什么标记方法很多，选择什么标记方法(fngf)主要视个人的习惯和可利用条件而定。主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法但在选择标记方法(fngf)时，还应考虑实验的要求，时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法如灵敏度和显示方法(fngf)等。等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。第54页/共62页第五十五页，共63页。随探针浓度增加，杂交率也增加。随探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。在较窄的范围内，随

33、探针浓度增加，敏感性增加。探针浓度过低会降低探针浓度过低会降低(jingd)杂交的灵敏度，过高又杂交的灵敏度，过高又会增加背景的染色。会增加背景的染色。一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最大一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最大结合度的最低探针浓度。结合度的最低探针浓度。第55页/共62页第五十六页，共63页。传统杂交率分析主要用于传统杂交率分析主要用于DNADNA复性研究，在这种情复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同(xin (xin tn)tn)。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。在液相，故其浓度不能精确计算。第56页/共62页第五十七页，共63页。理想的情况是在杂交速率最大的温度条件理想的情况是在杂交速率最大的温度条件(tiojin)(tiojin)下进行杂交反应下进行杂交反应对对RNARNA：DNADNA杂交来说，最大速率的产生点为杂交来说，