基因敲除小鼠技术专题ppt课件

1、转基因、基因敲入/敲除动物技术曾经成为现代生命科学根底研讨和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术不断以来经久不衰，并逐渐从根底研讨实验室转向商业方式，成为一项高度规范化的新兴产业。转基因、基因敲入/敲除动物技术曾经成为现代生命科学根底研讨和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术不断以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且好像剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从根底研讨

2、实验室转向商业方式，成为一项高度规范化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。虽然如此，传统技术依然存在一些难以抑制的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、胜利率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有能够将这一局面彻底改动。基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理开展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组homologousrecombination的原理，初次实现了ES的外源基因的定点整合targetedintegration，这一技术称为"基因打靶"genetargeting或&a

3、mp;quot;基因敲除"geneknockout，利用这种ES的显微注射就可以制造出基因敲出小鼠KOMice:knockoutmice;由于这一任务，Capecchi和Smithies于2019年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组homologousrecombination定义：是指发生在姐妹染色单体sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制造过程中，需求针对目的基因两端特异性片段设计带有一样片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中一样的片段会发生同源重组，如图

4、1所示：图2.基因敲除鼠制造过程表示图1、Knockout载体设计与构建根据研讨工程详细情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA片段都重组到带有标志基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。2、KnockoutES细胞挑选Knockout载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转入ES细胞，经过载体上的正负挑选基因获得阳性的KnockoutES克隆。选取PCR鉴定打靶载体正确插入的ES基因组DNA用于SouthernBlot鉴定，将SouthernBlot鉴定的KnockoutES扩展培育并液氮保管。3、KnockoutES细胞囊胚注射得到嵌合体

5、小鼠扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的KnockoutES细胞，以囊胚显微注射的方式将一定数量的KnockoutES细胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，经过小鼠的毛色中来源于ES细胞毛色的比例判别嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中能够获得生殖系传送才干。4、由嵌合体小鼠繁衍出生殖遗传系Knockout小鼠将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，经过PCR方式检测小鼠能否含有打靶序列。如有，那么该小鼠为具备生殖遗传才干的Knockout小鼠(F1代鼠)。5、Knockout小鼠生殖系传送鉴定将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配，经过后代小鼠毛

6、色或PCR基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传送才干。常规基因敲除是经过基因打靶，把需求敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用NeoCassette交换掉。这样的小鼠其全身一切的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠普通用于研讨某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。二、条件性基因敲除小鼠ConditionalKnockout条件性基因敲除小鼠是经过基因打靶，把两个loxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进展杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而

7、该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为：1该基因有胚胎致死性；2用于研讨该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠Knockin一、ZFN技术制造基因敲除鼠ZFN可以识别并结合指定的基因序列位点，并高效准确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修正，这样研讨人员就可以随心所欲地进展基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只需百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能到达10%。利用这些技术进展小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节

8、，目前研讨者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶offtarget，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正由于这个缘由，利用ZFN技术进展小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。二、TALEN技术制造基因敲除鼠TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合恣意DNA序列的模块化蛋白，从而到达靶向操作内源性基因的目的，它抑制了ZFN方法不能识别恣意目的基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵敏性，使基

9、因操作变得更加简一方便。然而同样由于脱靶的问题，利用TALEN技术进展小鼠的基因修饰依然无法取代传统技术。一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制造基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必需和野生型小鼠配种以决议遗传改动的生殖系能否传送，这样能够获得转基因或打靶基因来源于胚胎干细胞稳定的生殖系传送的小鼠。普通情况下，大约能获得50%承继了目的基因的后代。二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义那么指一个机体身上有

10、两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此可以耐受,不产生排斥反响,相互间处在嵌合形状。在基因敲除鼠中指经过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传构造的细胞一种是基因型被改动了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞。三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进展。首

11、先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以经过打靶载体的设计和对同源重组子的挑选来实现。下一步经过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改动。Cre-LoxP系统既可以在细胞程度上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，经过识别LoxP位点将抗性标志基因切除，又可以在个体程度上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，挑选子代小鼠就可得到删除外源标志基因的条件性敲除小鼠。四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只需部分组织细胞整合有外源基因，那么称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。五、RO

12、SA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。ROSA26是一个平安区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。TaconicFarms,Inc.成立于1952年，是位于纽约哈得孙河谷地域的一家家族企业。自成立以来，公司不断是世界上最大的实验室啮齿动物供应商之一，在继续消费高质量、定义明确的大鼠和小鼠方面拥有良好的口碑。Taconic在转基因小鼠的定制设计和消费、小鼠和大鼠育种、屏障系统、基因和动物安康方面的专业阅历为利用活体模型开展药物开发的研讨人员提供支持。Taconic在美国和欧洲设有六个育种工厂和三个效力实验室，员工人