蛋白浓度测定的方法说课材料

1、蛋白质含量测定蛋白质含量测定(cdng)的方法的方法 1、微量凯氏定氮法2、双缩脲法（Biuret）3、Folin-酚试剂(shj)法（Lowry）4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法（Bradford）6、BCA比色法第一页，共7页。1、微量凯氏（、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法 原理：含氮有机物与浓硫酸共热分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫原理：含氮有机物与浓硫酸共热分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。的

2、程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：若以甘氨酸为例，其反应式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)为了加速消化，可以加入为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白计算所得结果为样品总氮量，如欲求

3、得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。即得。 灵敏度：低。灵敏度：低。0.2 1.0mg氮，误差为氮，误差为 2 时间：费时时间：费时 810小时小时 说明：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长说明：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 干扰物质干扰物质(wzh)：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 第二页，共7页。2、双缩脲法（、双缩脲法（Biuret法）法） 原理：蛋白质含有两个以上的肽

4、键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成形成紫色络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分(chng fn)无关，故可用来无关，故可用来测定蛋白质含量。测定蛋白质含量。多肽键碱性多肽键碱性Cu2紫色络合物紫色络合物 灵敏度：低。灵敏度：低。120mg时间：中速，时间：中速，2030分钟分钟优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。优点：较快速，不同的蛋白质产生

5、颜色的深浅相近，以及干扰物质少。缺点：灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的缺点：灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。蛋白质测定。干扰物质：硫酸铵、干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等缓冲液和某些氨基酸等说明：用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似说明：用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 第三页，共7页。3、Folin酚试剂酚试剂(shj)法（法（Lowry法）法） 显色原理：与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，显色原理：与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，Folin酚，以增加显色量提高灵酚，以增加显色量提

6、高灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。敏度。这两种显色反应产生深蓝色，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的含量成正比。蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的含量成正比。干扰物质：硫酸铵；干扰物质：硫酸铵； Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 ；酚类、柠檬酸、糖类、甘油等。浓；酚类、柠檬酸

7、、糖类、甘油等。浓度较低的尿素（度较低的尿素（0.5%），硫酸钠（），硫酸钠（1%），硝酸钠（），硝酸钠（1%），三氯乙酸（），三氯乙酸（0.5%），乙醇），乙醇（5%），乙醚（），乙醚（5%），丙酮（），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度氢氧化钠溶液的浓度12倍。倍。灵敏度：

8、高，灵敏度：高， 5mg 。20250mg。时间：慢速，时间：慢速，4060分钟分钟优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点：费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，缺点：费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。干扰物质较多。说明：颜色深浅随不同蛋白质变化。也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。加说明：颜色深浅随不同蛋白质变化。也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。加Folin酚试酚试剂时要特别小心，该试剂仅在酸性剂时要特别小心，该试剂仅在酸性(sun xn)pH条件下稳定，但上述

9、还原反应只在条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。第四页，共7页。4、紫外吸收、紫外吸收(xshu)法法原理：由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收原理：由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成

10、正比，可用作定量测定处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定(cdng)。灵敏度：较高，灵敏度：较高，50100mg时间：时间：510分钟分钟干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定(cdng)。特别适用于柱。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，利用层析洗脱液的快速连续检测，利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。最常用的方法。缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲

11、线法测定缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定(cdng)蛋白质含量时，对那些与标蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定(cdng)与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定过校正，

12、测定(cdng)的结果还是存在一定的误差。的结果还是存在一定的误差。说明：用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正说明：用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 。由于蛋白质吸收高峰常因。由于蛋白质吸收高峰常因pH的改的改变而有变化，因此要注意溶液的变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定值，测定(cdng)样品时的样品时的pH要与测定要与测定(cdng)标准曲标准曲线的线的pH相一致。相一致。 第五页，共7页。5、考马斯亮兰法（、考马斯亮兰法（Bradford法）法） 原理：原理：1976年由年由Bradford根据蛋白质与染料相结合的原理设计根据蛋白质与染料相结合的原理设计(shj)。

13、考马斯亮兰。考马斯亮兰G-250染料，染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。残基相结合。在在595nm下测定的吸光度值下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。与蛋白质浓度成正比。灵敏度：最高。灵敏度：最高。15mg 时间：时间：515分钟分钟干扰物质：强碱性缓冲液；干扰物质：强碱性缓

14、冲液；TritonX-100; SDS；去污剂。；去污剂。优点：（优点：（1）灵敏度高。（）灵敏度高。（2）快速、简便，只需加一种试剂。（）快速、简便，只需加一种试剂。（3）干扰物质少。）干扰物质少。缺点：（缺点：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差。球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定。）仍有一些物质干扰此法的测定。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。蛋白质的浓度。 说明：最好的方法；说明：最好的方法； 干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化 第六页，共7页。6、BCA比色法比色法 原理：在碱性溶液中，蛋白质将原理：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还愿为还愿为Cu+再与再与BCA试剂（试剂（4，4 -二羧酸二羧酸-2，2 -二喹啉钠）生成紫色复合物，于二喹啉钠）生成