第15章 核酸的研究方法

1、第第1515章章核酸的研究方法核酸的研究方法 制备天然核酸必需采用温和的条件，制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定真核真核DNADNA以核蛋白（以核蛋白（DNPDNP）形式存在，）形式存在，DNPDNP溶于水溶于水或高盐溶液（或高盐溶液（1mol/L NaCl1mol/L NaCl），但不溶于低盐），但不溶于低盐溶液（溶液（0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。去除蛋白质：

2、水饱和酚，氯仿异戊醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇（一）（一）DNA分离纯化分离纯化制备制备RNARNA时，最重要的是使时，最重要的是使RNaseRNase灭活：灭活：所有容器都要经过所有容器都要经过高温处理高温处理，不能高温高，不能高温高压的用压的用0.10.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）处理。处理。加入加入强变性剂强变性剂（如胍盐）使（如胍盐）使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反应体系内加入的反应体系内加入RNaseRNase的的抑制剂抑制剂（如（如RNasin)RNasin)（二）（二）RNA的分

3、离的分离（三）核酸含量的测定（三）核酸含量的测定2、定糖法定糖法 RNA：核糖核糖 糠醛糠醛 绿色物质（绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖脱氧核糖+二苯胺二苯胺兰色物质（兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法紫外吸收法1个个A50g/ml 双链双链DNA 40g/ml RNA或单链或单链DNA3、定磷法定磷法 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于磷相当于10.5g核酸核酸4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭溴乙锭能插入能插入DNA分子的碱基分子的碱基对对间形成复合物间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光在紫外线照射下溴乙锭发橘

4、红色荧光 荧光强度与荧光强度与DNA含量成正比含量成正比纯纯DNA DNA 比值比值1.81.8， 1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯RNA RNA 比值比值2.02.0， 2.0 DNA 2.0 DNA、 PrPr、苯酚污染、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260OD280二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象心可以将不同构象DNADNA、RNARNA与蛋白质区分开来与蛋白质区分开来8M CsCl，45

5、000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=CsCl密度密度=离心力离心力=0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：样品到转轴的距离：样品到转轴的距离（一）核酸密度的测定G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10 （二）测定（二）测定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA变性变性DNA双链双链DNA 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，

6、浮力密度越大（三）研究核酸的构象（三）研究核酸的构象（四）用于核酸的制备（四）用于核酸的制备超螺旋超螺旋DNADNA或或用于大片段用于大片段DNA的分离，精度低，但的分离，精度低，但分离范围广。分离范围广。三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相对分子质量小于相对分子质量小于1000bp1000bp的的DNADNA片断片断和和RNARNA的电泳。的电泳。PAGEPAGE中一般不含中一般不含RNaseRNase，用于，用于RNARNA分分析时不会分解样品。析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳

7、（PAGEPAGE）（一）（一）DNADNA的酶法测定的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定英国英国 SangerSanger1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰岛素结构，1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一段与待测合成一段与待测DNADNA序列互补的序列互补的DNADNA片段群。片段群。 末端终止法末端终止法Sanger22，33双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）是）是DNADNA合成链延伸的合成链延伸的抑制抑制剂剂

8、。MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）（二）DNADNA的化学法测序：的化学法测序： 由由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所发明。所发明。 其基本原理是用特异的其基本原理是用特异的化学试剂化学试剂作用于作用于DNADNA分子中的不同碱基，然后用分子中的不同碱基，然后用哌啶哌啶切断反应碱基切断反应碱基的多核苷酸链。用的多核苷酸链。用4 4组不同的特异反应，可使末组不同的特异反应，可使末端标记的端标记的DNADNA分子切成不同长度的片断，其末端分子切成不同长度的片断，其末端都是该

9、特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱影得到测序图谱 4 4组特异的反应如下：组特异的反应如下：（1 1）G G反应：反应：用硫酸二甲酯用硫酸二甲酯DMSDMS使鸟嘌呤上的使鸟嘌呤上的N N7 7原子甲原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂裂（2 2）G+AG+A反应：反应：用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子质子化，原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3 3）T+CT+C反应：反应：用肼使用肼使

10、T T和和C C的嘧啶环断裂，再用哌啶的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基除去碱基（4 4）C C反应：反应：当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有C C与肼反应，并被哌与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂二酯键断裂 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处： 32p ，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）： *A*ACTTCG *ACTTCGA *AC

11、TTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P *ACTTCGACAG（三）（三）RNARNA的测序的测序 RNARNA的测序方法有的测序方法有3 3个：个：（1 1）用酶特异切断）用酶特异切断RNARNA链：链：（2 2）用化学试剂裂解）用化学试剂裂解RNARNA（3 3）逆转录成）逆转录成cDNAcDNA19951995年年K.MullisK.Mullis发明。基本步

12、骤为：发明。基本步骤为：1.1.设计一对引物以便有效扩增所需要的设计一对引物以便有效扩增所需要的DNADNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.2.优化反应体系：包括适量模板、引物、优化反应体系：包括适量模板、引物、4 4种种dNTPdNTP、Taq DNATaq DNA聚合酶和适量聚合酶和适量MgMg2+2+五、五、DNADNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）3.3.选择选择3 3个温度进行热循环：个温度进行热循环：变性变性9494，454560s60s；退火，根据引物的退火，根据引物的Tm Tm ，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。循环循环4.4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果啶染色，紫外光下检测结果y=产物；产物；x=扩增效率；扩增效率；n循环次数循环次数(1)nyx 如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。数量满足实验需求为止。模板模板DNA（单链）（单链）引物引物DNA聚合酶（聚合酶（Taq）dNTPMg2+MOV:MCB4.0POLYM