磁珠富集法筛选白鲢的微卫星分子标记

1、磁珠富集法筛选白鲢的微卫星分子标记 摘要 通过磁珠富集法筛选白鲢的微卫星分子标记。从血液中提取白鲢大片段基因DNA，限制性内切酶Sau3A I部分消化，使大部分片段介于400900 bp，低熔点琼脂糖凝胶回收。在筛选的基因组片段上连接1个20bp的双链接头，构建白鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针(CA)15 进行筛选，磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段，获得含有微卫星的单链序列. 将这些序列通过PCR扩增，连接PGEM -T 载体转化入感受态大肠杆菌DH5，得到一个微卫星序列文库;又经同位素标记的微卫星探针(CA)15 进行第2次筛选，获得149个阳性克隆，经测序分析，获得微卫星

2、序列138个，这可用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物81对。 微卫星是近十几年来发展起来的一种新的分子标记，它是指以少数几个核苷酸(1 6 个)为单位多次重复的简单序列，其中以双核苷酸重复最为常见。微卫星分子标记的发展主要受限于微卫星及其旁侧特异引物区的分离。水产动物微卫星的分离在鲤鱼、对虾、 扇贝等已报道，并逐步应用于相关种群的遗传多样性检测和遗传图谱的构建。 目前微卫星序列的获得主要有两种途径：一种是用经典的分子生物学方法构建富含有微卫星位点的基因组文库，通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆，但是筛选过程较复杂，筛选效率低，需要大量的人力和资金的投入；另一种是从已

3、知的核酸序列中进行检索，但是可检索的资源相对有限。因此，寻求新的微卫星分离方法，加快水产动物微卫星的分离和应用显得异常重要，徐鹏等在这方面做了一些尝试。 用生物素包被的磁珠富集法分离微卫星分子标记是一种简单高效的方法，已用于一些植物和动物微卫星分子标记的分离，但在水产动物方面的应用还未见报道。本研究尝试用磁珠富集的方法筛选白鲢的微卫星分子标记，以期为这一方法在水产动物方面的应用做一些探索，同时，分离出一些白鲢的微卫星分子标记，丰富水产动物分子标记资源，为白鲢养殖品系的优化，遗传多样性的检测及遗传图谱构建等打下基础。 1 材料和方法 1.1白鲢基因组DNA片段的提取和酶切 采白鲢的血液，每0.1

4、mL血浆加0.9 mL裂解液, 37 消化过夜，用等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液(25： 24 ：1)抽提3 次。然后用0.05 mol/LTris-HCl(pH8.0)和0.01 mol/L EDTA (pH 8.0)透析16 h 。无水乙醇沉淀，溶于0.1TE。用限制性内切酶Sau3A I酶切，1% 琼脂糖凝胶电泳检测，切下400 900 bp片段用试剂盒进行回收备用。 1 .2 基因组片段同接头的连接 1 .2 .1 接头的制备 用单链的寡核苷酸做接头，每种寡核苷酸的浓度均为50mol/L。实验所用接头：寡核苷酸链A ：5-G A T C G T C G A C G G T A C C

5、G A A T T C T寡核苷酸链B ：5-G T C A A G A A T T C G G T A C C G T C G A C 等比例的混合2组寡核苷酸A、B ,使其每组的最终浓度为25mol/L，退火以形成带有限制性酶切位点的双链接头。退火方法是：95变性10 min ，然后用4h冷却到10。缓慢降温形成接头的过程非常重要，可以根据实验室条件选用PCR仪，设计程序进行。 1 .2 .2 片段同接头的连接 建立20L的反应体系，每次反应用10L接头，由于接头对于DNA片段是过量的，所以可以把一次回收的DNA片段50烤干使用。16过夜连接。 1 .2 .3 过柱除去多余的接头 用旋离柱

6、离心去除多余的接头，并最终浓 缩到15L左右，1%琼脂糖凝胶电泳检测，看接头是否去除干净，由于多余的寡核苷酸接头会影响后面的PCR扩增，所以一定要把多余的接头去除干净。 1.3 利用接头连接片段创建基因组PCR文库 用连有接头的DNA片段作为模板，寡核苷酸链B作为引物，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。程序为94预变性3min，94 1min，58 1min，72 1min，30个循环，最后72 延伸10min。反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应dNTP，并浓缩到15L左右。电泳检测。 1 .4 用生物素标记的微卫星探针和Dynal磁珠与微卫星文库杂交、富集和捕获 1 .4

7、 .1 杂交 根据实验材料建立50L反应体系, 1.5L(10 mol/L)生物素标记的(CA)15 探针、5L(50mol/L)合成接头的寡核苷酸链B引物、15L20SSC、 0.5L10%SDS和16L ddH2O ，混合，68预热。将12L (276ng)DNA95变性5min，加入预热的杂交混合液，68杂交1h。杂交过程中平衡磁珠。 1 .4 .2 磁珠的平衡 将磁珠轻轻摇匀，吸出100 L到500L的硅化离心管中，放在磁力架上1 2 min ，轻轻吸出盐溶液。用200LB&W洗液洗涤2次,再用200L洗液（6SSC和0.1%SDS）反复洗涤平衡，直到磁珠表面变得顺滑易洗脱。加入200

8、L洗液，室温放置直到杂交完毕。 1 .4 .3 磁珠吸附富集 磁珠上包被有链霉亲和素，可与探针上的生物素结合，从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来。 将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠中，25 温育20min ，并轻轻摇动使生物素和链霉亲和素充分结合。温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液。依次用洗液，洗液II， 洗液III 洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列。洗涤方法是：洗液I在室温洗2 次，每次静置10min；洗液 II在68洗2次，每次静置15 min；洗液III在室温快速洗2次，即可基本将不含微卫星的序列去除干净。 1.4.4 捕获含有微卫星序列的单链DNA 用20

9、0L0.1TE在室温快速洗2次，加入50L0.1 TE 95变性10 min ,释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用。 1 .5 PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段 PCR反应体系25L，内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18L, 引物0.5L,TaqDNA 聚合酶0.5L, 根据DNA模板的浓度加入不多于4L的模板，加无菌水补足PCR仪进行扩增。反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应的dNTP，并浓缩到15L左右，电泳检测。 1 .6 连接T-载体，克隆 建立10L连接反应体系：2连接酶缓冲液5L, pGEM-T vector 1L，插入DNA片段2L，T4D

10、NA连接酶1L(3U/L )，加无菌去离子水补足10L，同时T载体自身连接作为对照，4连接过夜。用CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5a进行转化，得到微卫星基因组文库。 1 .7 原位杂交，用同位素探针进行二次筛选 通过原位杂交对微卫星文库进行二次筛选。将转化所得的克隆转化到杂交膜上，同时保留完全相同大小的菌板，以待杂交结果出来后挑取阳性克隆。用同位素标记的(CA)15进行杂交，压X光片，70放射自显影7d(可视信号强弱增减放射自显影的时间)。挑取阳性克隆进行测序分析。 2 结果和分析 实验共获得微卫星基因组文库1200个克隆，T载体自连的比例为35.22%，得到778个重组克隆。通过杂交进行

11、2次筛选，得到阳性克隆149个(19.15%)，测序得到138个微卫星序列。 按照Weber(1990)提出的测序标准进行分类，完美型、非完美型和混合型，分别占65.22%(40)、 21.74%(30)和13.04%(18)。另外，重复次数在10次以下的微卫星占28.26%(39)，10次以上的微卫星占71.74% (117)，总体所得微卫星序列较长。 在138 个微卫星序列中，除了一些微卫星序列因本身结构或两端太短不能设计引物外，其余微卫星利用引物设计软件Primer Premier 5.0 设计引物，共设计引物81 对, 经优化P C R 扩增条件，在适合的退火温度可以扩出目的条带，有待

12、应用于遗传多样性检测等方面的研究。 3 讨论 磁珠富集法是一种高效而简单快速的筛选微卫星的方法，整个过程可在一个星期完成，如果利用蓝白斑筛选克隆，从理论上讲，每一个白色菌斑都应当含有微卫星序列。但是，操作过程中一些因素会影响筛选微卫星效率，最主要的影响因素是磁珠的平衡洗液和洗涤温度的严格控制。磁珠用前需要用盐溶液反复平衡，根据经验，一般新鲜磁珠较容易平衡，而在4存放时间较长的磁珠不易平衡，需要反复多次直到磁珠顺滑； 另一方面，洗液的配置及洗涤温度要严格控制，以达到清除不含微卫星序列的片段的目的，同时，保护吸附的含有微卫星序列的片段不被洗脱，整个操作过程要轻，以达到最高的分离效率。 本实验初次筛选的效率为19.15%，高于常规方法筛选微卫星的效率，但是，远低于本方法所能够达到的效率，可能在2次杂交过程中有误差致使一些微卫星序列单链没有暴露出来，被同位素探针很好的杂交。 由于在富集的过程中，磁珠经过多个洗涤的过程，所以不可避免地将一些因重复数目较少而附着不牢固的微卫星序列清洗除去，致使所获得的微卫星序列较长，重复次数较多。Valdesetal. 认为在人类中重复次数低于5的微卫星,几乎检测不出多态性。Smul-dersetal. 认为重复次数多的微卫星既能在种间又能在种内产生多态性, 但重复次数少的微卫星,仅能在种间产生多态性。Xuetal.对斑节对虾进行微卫星引物设计，结果