DNA重组技术与基因操作学习教案

1、会计学1DNA重组技术与基因操作重组技术与基因操作第一页，编辑于星期六：六点 二十四分。DNA重组重组技术要有四技术要有四个必要条件个必要条件：工具酶、工具酶、基因、基因、载体、载体、受体细胞受体细胞第1页/共85页第二页，编辑于星期六：六点 二十四分。第2页/共85页第三页，编辑于星期六：六点 二十四分。第3页/共85页第四页，编辑于星期六：六点 二十四分。5G AATTC33CTTAA G5切割切割5-G -CTTAAAATTC-3 G-5+5CTGCA G33G ACGTC55-CTGCA 3-G G-3ACGTC-5+5CCC GGG3 GGG CCC5CCC GGGGGG3CCC+第

2、4页/共85页第五页，编辑于星期六：六点 二十四分。第5页/共85页第六页，编辑于星期六：六点 二十四分。第6页/共85页第七页，编辑于星期六：六点 二十四分。第7页/共85页第八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第8页/共85页第九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第9页/共85页第十页，编辑于星期六：六点 二十四分。5 HOOH 3HOOH355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端532 POH 3HO32P3532P ATP第10页/共85页第十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。5 POH 3HOP355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端OHHO5HOOH 335第11页/共85页第十二

3、页，编辑于星期六：六点 二十四分。第12页/共85页第十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。第13页/共85页第十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。ABOCSCL第14页/共85页第十五页，编辑于星期六：六点 二十四分。第15页/共85页第十六页，编辑于星期六：六点 二十四分。第16页/共85页第十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。第17页/共85页第十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第18页/共85页第十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第19页/共85页第二十页，编辑于星期六：六点 二十四分。第20页/共85页第二十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第21页/共85页第二十二页

4、，编辑于星期六：六点 二十四分。穿梭质粒穿梭质粒:人工人工构建的具有两种构建的具有两种不同复制起点和不同复制起点和选择记号，可在选择记号，可在两种不同的寄主两种不同的寄主细胞中存活和复细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体。第22页/共85页第二十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。第23页/共85页第二十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。第24页/共85页第二十五页，编辑于星期六：六点 二十四分。整合切割区域整合切割区域尾部基因尾部基因头部基因头部基因粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端负责负责DNA复制的基因复制的基因细胞裂解基因细胞裂解基因噬菌体的噬菌体的DNA示意图示意图左臂左臂右臂右臂

5、第25页/共85页第二十六页，编辑于星期六：六点 二十四分。第26页/共85页第二十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。噬菌体噬菌体DNA分子示意图分子示意图第27页/共85页第二十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第28页/共85页第二十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第29页/共85页第三十页，编辑于星期六：六点 二十四分。第30页/共85页第三十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第31页/共85页第三十二页，编辑于星期六：六点 二十四分。第32页/共85页第三十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序第33页

6、/共85页第三十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。利用柯斯质粒克隆大片段利用柯斯质粒克隆大片段DNA第34页/共85页第三十五页，编辑于星期六：六点 二十四分。pYAC4结构图结构图第35页/共85页第三十六页，编辑于星期六：六点 二十四分。YAC的构建示意图的构建示意图第36页/共85页第三十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。第37页/共85页第三十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第38页/共85页第三十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第39页/共85页第四十页，编辑于星期六：六点 二十四分。第40页/共85页第四十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第41页/共85页第四十二页

7、，编辑于星期六：六点 二十四分。Pst1质粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端转移酶加（用末端转移酶加（dG）残基）残基用末端转移酶加（用末端转移酶加（dC）残基）残基以以oligo(dT)作引物合成作引物合成cDNA第一链第一链合成合成cDNA第二链第二链退火退火第42页/共85页第四十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCC G G CCCCCCTTTTTTTGGGGG

8、GACGTC转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性转化过程中，转化过程中，DNA上的缺口为宿主酶所修复，从而在上的缺口为宿主酶所修复，从而在cDNA两端恢复两端恢复Pst1位点位点Pst1Pst1cDNA第43页/共85页第四十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。第44页/共85页第四十五页，编辑于星期六：六点 二十四分。第45页/共85页第四十六页，编辑于星期六：六点 二十四分。5353变性、转膜变性、转膜5335加入经标记、变性的探针进行分子杂交加入经标记、变性的探针进行分子杂交53353355* * * * *含有杂交信号的含有杂交信号的DNA分子分子第

9、46页/共85页第四十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。第47页/共85页第四十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。在培养基上培养菌落在培养基上培养菌落转膜转膜菌落的蛋白质裸露出来菌落的蛋白质裸露出来一抗与裸露的蛋白质结合一抗与裸露的蛋白质结合二抗与一抗结合二抗与一抗结合显色显色找出阳性克隆找出阳性克隆裂解裂解加一抗加一抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的二抗，加显色剂洗去游离的二抗，加显色剂第48页/共85页第四十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。克隆克隆PCR产物；产物；通用引物：通用引物：pUC/M13 primer第49页/共85页第五十页，编辑于星期六：六点

10、二十四分。8、DNA的序列分析：的序列分析： 这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最确定的方法。的唯一方法，也是最确定的方法。 第50页/共85页第五十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第51页/共85页第五十二页，编辑于星期六：六点 二十四分。第52页/共85页第五十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。oligo(dT)作作为引物为引物第53页/共85页第五十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。随机随机引物引物第54页/共85页第五十五页，编辑于星期六：六点 二十四分。第55页/共85页第五十六页，编辑于星期六：六

11、点 二十四分。自身引导法自身引导法第56页/共85页第五十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。反转录酶反转录酶RNaseH（部分降解）（部分降解）DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶RNA55cDNA第一链第一链33RNA55555555cDNA第一链第一链3cDNA第二链第二链置置换换合合成成法法第57页/共85页第五十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第58页/共85页第五十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第59页/共85页第六十页，编辑于星期六：六点 二十四分。535353退火退火DNA连接酶连接酶退火退火DNA连接酶连接酶退火退火DNA连接酶连接酶退火退火T4D

12、NA连接酶连接酶EcoRBamH合成的合成的DNA全基因全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因合成的基因转化转化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的基因合成的基因第60页/共85页第六十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第61页/共85页第六十二页，编辑于星期六：六点 二十四分。磷酸化磷酸化退火退火DNA多聚酶多聚酶Iklenow片段片段dNTP限制性内切酶限制性内切酶分子克隆分子克隆5555第62页/共85页第六十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。第63页/共85页第六十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。第64页/共85页第六十五页，编

13、辑于星期六：六点 二十四分。第65页/共85页第六十六页，编辑于星期六：六点 二十四分。帽子帽子AAAAA mRNA35TTTTT以其为模板进行以其为模板进行PCR扩增扩增逆转录逆转录合成合成cDNA互补链并退火互补链并退火寡聚寡聚dT引物引物第66页/共85页第六十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。第67页/共85页第六十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第68页/共85页第六十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第69页/共85页第七十页，编辑于星期六：六点 二十四分。53DNA序列序列GGGGG 353GGGGG5GGGGG 353GGGGG5锚定引物锚定引物CCCCC（多聚（多聚d

14、C引物）引物）进行进行PCR扩增扩增5GGGGG 3CCCCC加多聚加多聚dG尾巴尾巴加入引物加入引物已知序列已知序列扩出的未知序列扩出的未知序列第70页/共85页第七十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第71页/共85页第七十二页，编辑于星期六：六点 二十四分。53LR酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点LRLRLR53已知序列已知序列限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解环化环化变性并加入根据已知序列合成的引物变性并加入根据已知序列合成的引物PCR扩增扩增第72页/共85页第七十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。第73页/共85页第七十四页，编辑于星期六：六点 二十四分。第74页/共85页第七十

15、五页，编辑于星期六：六点 二十四分。第75页/共85页第七十六页，编辑于星期六：六点 二十四分。5GTAAAAA3polyAmRNA反转录反转录5T11-12MN35GTAAAAA33CATTTTT5cDNA 第一链第一链5GTAAAAA33CATTTTT5变性变性变性变性3端锚定引物寡核苷酸端锚定引物寡核苷酸，5端随机引物端随机引物5GTAAAAA33CATTTTT53TTT5CATTCATTTTT53第76页/共85页第七十七页，编辑于星期六：六点 二十四分。延伸延伸TTT5CATT35GTAAAAA3cDNA 第二链第二链变性变性退火退火延伸延伸电泳电泳显带显带mRNA DDmRNA D

16、D技术原理图技术原理图第77页/共85页第七十八页，编辑于星期六：六点 二十四分。第78页/共85页第七十九页，编辑于星期六：六点 二十四分。第79页/共85页第八十页，编辑于星期六：六点 二十四分。正向、反向正向、反向SSH第80页/共85页第八十一页，编辑于星期六：六点 二十四分。第81页/共85页第八十二页，编辑于星期六：六点 二十四分。 cDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增Rapid Amplification of cDNA End（RACE） 以以获获得全得全长长的的cDNA片段片段第82页/共85页第八十三页，编辑于星期六：六点 二十四分。用同聚物加尾法再生用同聚物加尾法再生Hind识别位点识别位点AAGCTTTTCGAA载体分子载体分子35加加Hind酶酶AAGCTTTTCGAA553355AAGTCAGCTTTTCGATGCAA53