第十一章荧光分析法

1、1第 十 一 章 荧 光 分 析 法21）光致发光：分子）光致发光：分子吸收吸收某种波长的光后某种波长的光后发射发射出比原来吸收光的出比原来吸收光的波长更长波长更长的光的现象的光的现象荧光荧光 磷光磷光2）荧光分析法：根据物质的荧光谱线的位置）荧光分析法：根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法优点：灵敏度高、选择性好优点：灵敏度高、选择性好3）分类）分类原子荧光原子荧光紫外可见荧光紫外可见荧光红外荧光红外荧光X射线荧光射线荧光3第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理 一、分子荧光一、分子荧光 （一）分子荧光的产生（一）分

2、子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程 电子能级电子能级中包括振动能级和转动能级中包括振动能级和转动能级 电子能级多重性：电子能级多重性：M2s+1 s为总自选量子数为总自选量子数 单重态单重态S M1 自旋相反自旋相反 三重态三重态T M3 自旋相同自旋相同41）根据）根据“能量最低原则能量最低原则”和和“Pauli不相容原不相容原则则”，基态基态时分子中的电子对填充在时分子中的电子对填充在能量最低能量最低的的轨道，且轨道，且自旋相反自旋相反，即总自旋量子数为，即总自旋量子数为02）激发态：电子对）激发态：电子对自旋相反自旋相反，处于激发单重态，处于激发单重态电子

3、对电子对自旋相同自旋相同，处于激发三重态，比激发单重，处于激发三重态，比激发单重态能量低态能量低52.荧光的产生荧光的产生过程过程1：吸收紫外可见光，基态电子跃迁到单重：吸收紫外可见光，基态电子跃迁到单重激发态的各个不同能级上。根据自旋禁阻选律激发态的各个不同能级上。根据自旋禁阻选律不能直接跃迁到激发三重态的能级不能直接跃迁到激发三重态的能级过程过程2：激发态不稳定，释放能量返回基态：激发态不稳定，释放能量返回基态61）振动弛豫）振动弛豫 激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传递给溶剂分子，电子由同一电子激发态的较高传递给溶剂分子，电子由同一电子激发

4、态的较高振动能级回到较低振动能级。振动能级回到较低振动能级。10122）内部能量转换）内部能量转换 两个电子能级相差较小，振动能级部分重叠，两个电子能级相差较小，振动能级部分重叠，电子由高电子能级转移到低电子能级的过程。电子由高电子能级转移到低电子能级的过程。图图73）外部能量转换）外部能量转换 激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子碰激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子碰撞以热的形式释放能量。发生在第一激发态撞以热的形式释放能量。发生在第一激发态或激发三重态最低振动能级向基态转换的过或激发三重态最低振动能级向基态转换的过程。程。4）体系间跨越）体系间跨越 不同多重态不同多重态,有重叠的转动能级间的

5、非辐射有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。图图85）荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级）荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态基态（ 多为多为 S1 S0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光； 10-710 -9 s 。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 6）磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级）磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态基态 （ T1 S0跃迁跃迁

6、）；）； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。图图9返回6返回7返回810（二）荧光的激发光谱和发射光谱（二）荧光的激发光谱和发射光谱 1.激发光谱：表示不同激发波长的辐射引起物质发激发光谱：表示不同激发波长的辐射引起物质发 射荧光的相对效率。记录射荧光的相对效率。记录 荧光荧光 强度（强度（F）与激发波长（）与激发波长（exex） 的关系曲线的关系曲

7、线 2.发射光谱（荧光光谱）：保持发射光谱（荧光光谱）：保持 激发光的波长在最大激发波长，激发光的波长在最大激发波长， 测定发射的荧光在各个波长的强测定发射的荧光在各个波长的强 度，记录强度对发射波长（度，记录强度对发射波长（emem） 的关系曲线的关系曲线11123.溶液荧光光谱的特征溶液荧光光谱的特征 1）斯托克斯位移：发射波长总大于激发波长）斯托克斯位移：发射波长总大于激发波长 2）发射光谱的形状与激发波长无关）发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量能量(如能级图如能级图ex2 ,1)，产生不同吸收带，但均，产生

8、不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光到基态，产生波长一定的荧光(如如2 )。133）荧光光谱与激发光谱镜像关系）荧光光谱与激发光谱镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系谱形状一样）成镜像对称关系基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；振动能级分布类似；14二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件 1）具有合适的结构；）具有合适

9、的结构； 2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率：荧光量子产率：3)荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的度降低到最大荧光强度的1/e所需要的时间所需要的时间f发射荧光的光子数吸收激发光的光子数152.分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系 1）跃迁类型：）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越的荧光效率高，系间跨越 过程的速率常数小，有利于荧光的产生；过程的速率常数小，有利于荧光的产生； 2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率 并产生红移并产生红移 163）刚

10、性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。 174）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。18三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响温度的

11、影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。几率增加。3. 溶液溶液pH对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控；的影响较大，需要严格控；194.荧光熄灭剂荧光猝灭荧光熄灭剂荧光猝灭 1）定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质）定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 2）荧光熄灭剂：卤素离子、重金属离子、氧分）荧光熄灭剂：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羧基化合物等子、硝基化合物、重氮化合物、羧基化合物等 3）机理：）

12、机理： a碰撞失去能量碰撞失去能量 b生成不发光的配合物生成不发光的配合物 c氧的存在使荧光物质氧化或氧分子的顺磁性氧的存在使荧光物质氧化或氧分子的顺磁性 使激发单重态分子转变为三重态使激发单重态分子转变为三重态 204）荧光熄灭法：利用荧光强度的减弱和熄灭）荧光熄灭法：利用荧光强度的减弱和熄灭 剂的浓度呈线性关系剂的浓度呈线性关系5.散射光散射光 瑞利光：弹性碰撞，波长与入射光相同瑞利光：弹性碰撞，波长与入射光相同 拉曼光：非弹性碰撞，波长长移。拉曼光：非弹性碰撞，波长长移。 与荧光波长接近与荧光波长接近21第二节第二节 荧光分光光度计荧光分光光度计1.测量荧光的仪器主要由四个部分组成：测量

13、荧光的仪器主要由四个部分组成： 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。2.特殊点：有特殊点：有两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角。3.光源：氙灯光源：氙灯 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光 (测量测量)波长的第二单色器；波长的第二单色器； 样品池：石英比色皿样品池：石英比色皿 检测器：光电倍增管。检测器：光电倍增管。222324第三节第三节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、一、 特点特点 1.灵敏度高灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高

14、24个个数量级；数量级； 检测下限：检测下限：0.10.1g/mL-3 相对灵敏度：相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 2.选择性强选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； 3.试样量少试样量少 缺点：应用范围小。缺点：应用范围小。25二、定量依据与方法二、定量依据与方法 1.定量依据定量依据 荧光强度荧光强度F正比于吸收的光强（正比于吸收的光强（I0I） 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：0()FK II00lg10EclIAEclIII 2.300(1 10

15、)(1)ElcElcFK IK Ie02.3FK I EclKc26FKc2.定量方法定量方法 1）标准曲线法：）标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标 准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强 度，在标准曲线上求出浓度；度，在标准曲线上求出浓度； 272）比例法：）比例法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度0000ssxxsxxsFFcFFccFFcFF3）多组分样品的荧光分析）多组分样品的荧光分析 a无相互干扰，分别测定无相互干扰，分别测定 b有

16、干扰，同紫外可见吸收光谱定量方法有干扰，同紫外可见吸收光谱定量方法 解联立方程组法解联立方程组法 等吸收双波长消去法等吸收双波长消去法28三、荧光分析法的应用三、荧光分析法的应用1.无机化合物的分析无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测

17、定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定2.生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析29四、其他荧光分析技术四、其他荧光分析技术 1.激光荧光分析激光荧光分析 单色性极好，提高荧光分析的灵敏度和选择单色性极好，提高荧光分析的灵敏度和选择性性 2.时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。选择合适的延缓时间，可测定被测组分的荧光选择合适的延缓时间，可测定被测组分的荧光不受其他组分的荧光及噪声影响不受其他组分的荧光及噪声影响 时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术303.同步荧光分析同步荧光分析 选择选择（通常（通常 ），同步变化发），同步变化发射波长和激发波长进行扫描，得到同步荧光光谱射波长和激发波长进行扫描，得到同步荧光光谱（荧光强度与波长的图谱）（荧光强度与波长的图谱）特点：谱图简化、选择性提高、光散射干扰减少特点：谱图简化、选择性提高、光散射干扰减少4.4.胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光