《基因芯片技术》第5章基因芯片数据质量

1、基因芯片技术基因芯片技术Gene chip technology内容提要：内容提要：l第一节第一节 基因芯片数据质量基因芯片数据质量l第二节第二节 基因芯片弱信号处理基因芯片弱信号处理l第三节第三节 基因芯片数据归一化基因芯片数据归一化第五章第五章 生物芯片数据质量生物芯片数据质量生物学验证和解释生物学验证和解释芯片实验芯片实验实验设计实验设计图像处理图像处理数据归一化数据归一化生物问题生物问题假设检验假设检验差异基因差异基因分类分析分类分析数据分析数据分析聚类分析聚类分析失败失败通过通过数据预处理数据预处理质量控制质量控制第一节第一节 基因芯片数据质量基因芯片数据质量一、芯片图形常见问题一、

2、芯片图形常见问题二、芯片误差产生原因二、芯片误差产生原因三、如何减少芯片误差三、如何减少芯片误差四、芯片数据质量判断四、芯片数据质量判断五、芯片平台实验数据的评估五、芯片平台实验数据的评估一、芯片图像常见问题：一、芯片图像常见问题：（1）是否有杂质）是否有杂质（2）信号点强度是否太高或太低）信号点强度是否太高或太低（3）是否有刮擦痕迹）是否有刮擦痕迹（4）背景强度是否过高）背景强度是否过高图像和背景都很均一图像和背景都很均一信号强度不均一信号强度不均一可能是杂交液或者芯片本身有问题，需要重新进行杂交。可能是杂交液或者芯片本身有问题，需要重新进行杂交。擦擦痕痕质量好的双通道质量好的双通道cDNA

3、芯片芯片红色荧光背景高红色荧光背景高二、芯片误差来源分析二、芯片误差来源分析l基因芯片技术是一种基因芯片技术是一种半定量半定量的分析手段，存在误差、的分析手段，存在误差、且很难克服。且很难克服。l在芯片实验中，要在芯片实验中，要尽量降低尽量降低误差，以提高数据分析的误差，以提高数据分析的准确性。准确性。 芯片误差来源芯片误差来源1 1）生物学差异生物学差异：内在的、受到遗传和环境因素影响。：内在的、受到遗传和环境因素影响。2 2）实验过程实验过程误差：误差：（1 1）芯片制备过程误差：克隆的准确性、）芯片制备过程误差：克隆的准确性、PCRPCR扩增及扩增及产物纯化过程、点样及点样后处理产物纯化

4、过程、点样及点样后处理（2 2）样本检测过程误差：）样本检测过程误差：RNARNA抽提和标记过程、杂交抽提和标记过程、杂交过程过程 （3 3）检测系统误差：硬件、软件）检测系统误差：硬件、软件误差原因误差原因克隆的准确性克隆的准确性 l目前目前cDNAcDNA克隆的主要来源是商业化公司提供的克隆，克隆的主要来源是商业化公司提供的克隆，其其克隆准确性仅为克隆准确性仅为65-85%65-85%l克隆误差产生主要原因：克隆误差产生主要原因：1 1）含质粒的细菌培养及质粒抽提过程中存在污染）含质粒的细菌培养及质粒抽提过程中存在污染2 2）克隆重排过程人为的错误）克隆重排过程人为的错误误差原因误差原因P

5、CRPCR扩增及产物纯化过扩增及产物纯化过程程 l影响影响cDNAcDNA质量的原因：质量的原因： A.A.模板的质量：最好是纯化的质粒，不能有污染。模板的质量：最好是纯化的质粒，不能有污染。B.PCRB.PCR引物序列的特异性：特异性低的引物会导致非引物序列的特异性：特异性低的引物会导致非特异性扩增、多带、拖尾、甚至无扩增产物。特异性扩增、多带、拖尾、甚至无扩增产物。 l纯化方法也会影响芯片质量纯化方法也会影响芯片质量 A.A.沉淀法：离心力不足，会导致回收率不稳定。沉淀法：离心力不足，会导致回收率不稳定。 B.B.树脂纯化法：成本比较高，纯化得率低于沉淀法。树脂纯化法：成本比较高，纯化得率

6、低于沉淀法。误差原因误差原因点样及点样后处理点样及点样后处理 l点样仪点样仪精密度精密度：影响芯片矩阵：影响芯片矩阵整齐度整齐度。l点样针清洗不彻底：导致点样针清洗不彻底：导致DNADNA探针间交叉污染。探针间交叉污染。l点样点样针磨损程度针磨损程度和针堵塞的情况：造成阳电点的大和针堵塞的情况：造成阳电点的大小和形状不同。小和形状不同。l点样后处理：包括水合、交联、洗脱未结合的探针、点样后处理：包括水合、交联、洗脱未结合的探针、封闭等步骤，这个过程会影响到封闭等步骤，这个过程会影响到DNADNA固定在芯片上的固定在芯片上的效率效率。误差原因误差原因RNARNA抽提方法抽提方法 lRNARNA的

7、质量直接影响标记效率和实验的成功率，的质量直接影响标记效率和实验的成功率，可以说是导致芯片实验失败的可以说是导致芯片实验失败的最主要的原因。最主要的原因。l不同物种、不同组织类型由于细胞成分的不同导不同物种、不同组织类型由于细胞成分的不同导致致RNARNA的纯度和得率有较大的差异，有些甚至需的纯度和得率有较大的差异，有些甚至需要特殊的实验流程，而芯片公司一般是要特殊的实验流程，而芯片公司一般是SOPSOP（标（标准化）作业。准化）作业。误差原因误差原因RNARNA的标记过程的标记过程 l标记反应的过程中不同的标记反应的过程中不同的mRNAmRNA，其逆转录效率，其逆转录效率会有所差异，从而导致

8、误差。会有所差异，从而导致误差。 l标记过程中产生误差的主要因素有：标记过程中产生误差的主要因素有：（1 1）mRNAmRNA的固有性质与逆转录酶的固有性质与逆转录酶（2 2）逆转录引物）逆转录引物 （3 3）荧光染料）荧光染料 （4 4）标记后产物纯化）标记后产物纯化误差原因误差原因杂交过程杂交过程 l杂交是个杂交是个非常复杂非常复杂的过程，受到的过程，受到1 1）杂交的时）杂交的时间和空间、间和空间、2 2）玻片的表面物质的亲水性和疏）玻片的表面物质的亲水性和疏水性、水性、3 3）探针在玻片表面上的分布和构型、）探针在玻片表面上的分布和构型、4 4）4 4）温度、）温度、5 5）杂交液配方

9、和浓度等影响，）杂交液配方和浓度等影响，l如果考虑到如果考虑到6 6）探针和靶序列的长度、）探针和靶序列的长度、7 7）G+CG+C含量、含量、8 8）SNPSNP等影响，情况会更复杂。等影响，情况会更复杂。误差原因误差原因硬件硬件l不同的扫描方式就会带来误差，即使使用同一不同的扫描方式就会带来误差，即使使用同一类但由不同公司生产的扫描仪，由于硬件配置类但由不同公司生产的扫描仪，由于硬件配置和光路设计的不同，也会带来一定的误差。和光路设计的不同，也会带来一定的误差。 l光漂白现象也会对芯片数据的质量带来一定的光漂白现象也会对芯片数据的质量带来一定的误差。误差。 误差原因误差原因软件软件 l不同

10、软件的核心算法不同，因此同一原始图片经不同软件的核心算法不同，因此同一原始图片经过不同软件处理后，数据会不同。过不同软件处理后，数据会不同。 l同一软件，取信号点和背景的原理也有好几种，同一软件，取信号点和背景的原理也有好几种，通过不同方法读取的数据，也有一定的偏差。通过不同方法读取的数据，也有一定的偏差。 l软件质量会影响扫描图像定位的准确度和数据的软件质量会影响扫描图像定位的准确度和数据的精确性等重要参数，因此需要精确性等重要参数，因此需要选择质量好的图像选择质量好的图像处理软件处理软件。 三、如何减少芯片误差三、如何减少芯片误差l实验设计实验设计1 1）重复：生物学重复、技术上重复）重复

11、：生物学重复、技术上重复2 2）直接比较：使用正反或环式标记法，平衡染料和样本）直接比较：使用正反或环式标记法，平衡染料和样本的差异。的差异。 l实验过程的质控实验过程的质控1 1）制备过程的原材料检测）制备过程的原材料检测2 2）生产过程）生产过程3 3）成品质控）成品质控l数据处理与矫正数据处理与矫正 减少误差减少误差对基片进行检测对基片进行检测l目前，国内外没有统一的基片质检方案。目前，国内外没有统一的基片质检方案。l好的基片好的基片背景低背景低DNADNA的固定能力强的固定能力强平整度，平整度，质检主质检主要考察这三个参数。此外，要检查是否有划痕和污点。要考察这三个参数。此外，要检查是

12、否有划痕和污点。l每批基片抽出一定比例，用标记有荧光染料的每批基片抽出一定比例，用标记有荧光染料的DNADNA探针探针点样、固定、洗脱，通过比较洗脱前后的荧光信号变化，点样、固定、洗脱，通过比较洗脱前后的荧光信号变化，测定基片的固定率。测定基片的固定率。 l基片表面的基片表面的化学基团的稳定性化学基团的稳定性较差，较差，保存时间保存时间对其固定对其固定的效率影响很大。的效率影响很大。减少误差减少误差对探针进行检测对探针进行检测l对于对于cDNAcDNA芯片，所获得的芯片，所获得的cDNAcDNA克隆克隆必须是经过严格测序的，必须是经过严格测序的，而且克隆的而且克隆的保存保存也必须严格，以防止污

13、染。在使用之前以及也必须严格，以防止污染。在使用之前以及PCRPCR之后，还应之后，还应抽出抽出5 5的克隆进行再测序的克隆进行再测序，以判断克隆的位，以判断克隆的位置是否有错乱或污染。置是否有错乱或污染。l对于直接点样的寡核苷酸芯片，对供应商提供的寡核苷酸质对于直接点样的寡核苷酸芯片，对供应商提供的寡核苷酸质量也有较高的要求，主要体现在纯度量也有较高的要求，主要体现在纯度序列的正确性序列的正确性浓度浓度等方面，一般需要等方面，一般需要HPLCHPLC纯化，并要求供应商提供质检结果。纯化，并要求供应商提供质检结果。l我们只能使用分光光度计测得其浓度和质量状况。我们只能使用分光光度计测得其浓度和

14、质量状况。根据测得根据测得浓度和体积计算出所给的探针总量。例如，浓度和体积计算出所给的探针总量。例如，260/280260/280应该大于应该大于1.61.6，以防止产品中有太多单核苷酸或者太多引物合成不完全。，以防止产品中有太多单核苷酸或者太多引物合成不完全。 减少误差减少误差对对PCRPCR产物进行质检产物进行质检lPCRPCR的污染控制是一个很重要的环节，应的污染控制是一个很重要的环节，应严格遵守操作严格遵守操作规程规程。l质检质检PCRPCR产物质量主要采用的方法是产物质量主要采用的方法是琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，一个合格的产物，要求电泳条带是清晰的单带。条带一个合格的产物，要求电

15、泳条带是清晰的单带。条带的亮度代表了扩增的量，如果是多条带或拖尾的亮度代表了扩增的量，如果是多条带或拖尾(smear)(smear)，则则PCRPCR产物的质量就达不到要求。产物的质量就达不到要求。l有条件的还可以对纯化后的每个有条件的还可以对纯化后的每个PCRPCR产物用产物用9696孔的紫外孔的紫外分光光度计分光光度计进行定量分析进行定量分析。 减少误差减少误差对玻片上对玻片上cDNA固定浓度检修检测固定浓度检修检测1. 荧光染料染色法：从各批次制备中抽取若干张芯片在配制染料（SYTO 61 ）中浸泡5分钟(室温)，依次用TE、H2O和无水乙醇洗涤。干燥后，用扫描仪对芯片进行扫描，扫描波长

16、为535 nm。2. 使用标记的寡核苷酸杂交：使用标记的寡核苷酸与cDNA杂交可以反映cDNA探针的相对量。3. 与组织的RNA杂交：这种方式完全与正式的实验相同，因此能最能真实反映芯片质量。 四、芯片数据的质量判断四、芯片数据的质量判断芯片数据的质量：芯片数据的质量：（1）整张芯片的质量）整张芯片的质量（2）芯片上各个点的质量）芯片上各个点的质量 评价芯片质量的方法：评价芯片质量的方法：（1）信噪比：最简单的方法就是计算整个芯片的信噪比。）信噪比：最简单的方法就是计算整个芯片的信噪比。信噪比太低表示整个芯片的背景太高信噪比太低表示整个芯片的背景太高，这张芯片的，这张芯片的质量质量不是很好不是

17、很好。（2）散点图）散点图散点图散点图l散点图：散点图：用来表示在用来表示在cDNAcDNA芯片中两个组织芯片中两个组织中基因表达量的中基因表达量的比例比例信息信息。 l横坐标：表示实验组横坐标：表示实验组织（织（Cy5Cy5标记）的样点标记）的样点信号强度对数值。信号强度对数值。l纵坐标：表示参照组纵坐标：表示参照组织（织（Cy3Cy3标记）的样点标记）的样点信号强度对数值。信号强度对数值。l4545度的对角线：基因度的对角线：基因表达稳定不变的区域。表达稳定不变的区域。B散点图的作用散点图的作用-对芯片质量进行监控对芯片质量进行监控 自身校验实验：自身校验实验：将一份样本平均分成两份进行将

18、一份样本平均分成两份进行自身校验实自身校验实验验，理论上所有点的位置都应在，理论上所有点的位置都应在4545度对角线上，但考虑到度对角线上，但考虑到系统误差，散点的分布表现一定的区域，分布区域越小，系统误差，散点的分布表现一定的区域，分布区域越小，系统越稳定，误差也越小。系统越稳定，误差也越小。 图片分析：图片分析：两条两条红色平行线表示红色平行线表示系统本身误差的系统本身误差的阈值，红色平行阈值，红色平行线中间的点表示线中间的点表示没有表达差异。没有表达差异。红色平行线以外红色平行线以外的区域则是偏离的区域则是偏离较大的点，在自较大的点，在自身比较中代表假身比较中代表假阳性。阳性。 M-AM

19、-A散点图散点图散点图与散点图与M-AM-A散点图比较散点图比较 l散点图：显示起来非常直接，但由于在实验中没有差异散点图：显示起来非常直接，但由于在实验中没有差异表达的基因总是占绝大多数，所以散点图往往表现出很表达的基因总是占绝大多数，所以散点图往往表现出很大的线性，以至于其他一些特性难以观察到。大的线性，以至于其他一些特性难以观察到。lM-AM-A散点图：散点图：1 1）增加了空间的延展性，显示了差异表达随强度的分布。）增加了空间的延展性，显示了差异表达随强度的分布。2 2）更易观察到两种荧光强度之间的一些非线性的特征。）更易观察到两种荧光强度之间的一些非线性的特征。单个点的质量单个点的质

20、量 l评估单个点质量的方法：评估单个点质量的方法：（1 1）根据点的物理特性）根据点的物理特性（2 2）评估点的强度：此点与同一张芯片或重复芯片上同）评估点的强度：此点与同一张芯片或重复芯片上同样基因的点强度是否一致。样基因的点强度是否一致。l重复点信号值：理论上是满足重复点信号值：理论上是满足正态分布正态分布，利用所有的重，利用所有的重复点求出它们所满足的正态分布，假如某个信号点的信复点求出它们所满足的正态分布，假如某个信号点的信号值显著偏离这个正态分布，那么这个信号点的数据质号值显著偏离这个正态分布，那么这个信号点的数据质量可能不是很好。量可能不是很好。如何处理质量低的信号：如何处理质量低

21、的信号：1 1）直接滤除质量低的信号点：这种处理有时候会过）直接滤除质量低的信号点：这种处理有时候会过于武断，因为一些低质量点也会蕴含有用的信息。于武断，因为一些低质量点也会蕴含有用的信息。2 2）给高质量点以高的权重值，低质量点以低的权重）给高质量点以高的权重值，低质量点以低的权重值，然后进行分析。值，然后进行分析。 基于芯片图像处理信号点的质量基于芯片图像处理信号点的质量 l信号点的大小和规则程度：一些信号点直径太小或者形状不信号点的大小和规则程度：一些信号点直径太小或者形状不规则，和圆相差太大，这些点通常认为质量不是很好；规则，和圆相差太大，这些点通常认为质量不是很好；2. 信噪比：只有

22、信噪比比较高的信号点，数据的可信度才高；信噪比：只有信噪比比较高的信号点，数据的可信度才高；3. 信号点周围的背景强度：某个信号点周围的背景远远大于其信号点周围的背景强度：某个信号点周围的背景远远大于其他信号点周围的背景，那么这个信号点很可能被污染了；他信号点周围的背景，那么这个信号点很可能被污染了；4. 信号点背景的均一程度：背景均一程度高的信号点，是质量信号点背景的均一程度：背景均一程度高的信号点，是质量高的点；高的点；5. 信号的饱和程度：饱和像素过多的信号点，数据准确性令人信号的饱和程度：饱和像素过多的信号点，数据准确性令人怀疑。怀疑。 五、芯片平台实验数据的评估五、芯片平台实验数据的

23、评估 芯片平台实验数据的评估：芯片平台实验数据的评估：通过芯片实验、数据提取获得通过芯片实验、数据提取获得的数据是否反映了实验的真实情况。的数据是否反映了实验的真实情况。要评价芯片数据的好坏，重复实验是必不可少的，目前不要评价芯片数据的好坏，重复实验是必不可少的，目前不同实验室采用不同的方法利用重复实验的数据进行评价，同实验室采用不同的方法利用重复实验的数据进行评价，可以大致地归纳为两大类可以大致地归纳为两大类: 一是筛选到的一是筛选到的差异表达基因差异表达基因的可的可靠性，二是靠性，二是统计分析系统的重复性统计分析系统的重复性。 评估参考：评估参考：自身比较实验自身比较实验 ：假阳性、假阴性

24、：假阳性、假阴性相关系数相关系数变异系数（变异系数（coefficient of variation, CV） r1/r2值值 自身比较实验自身比较实验 l自身比较实验自身比较实验（Self-comparison experiment，SCE）：）：实验组和对照组的实验组和对照组的RNA来自同一份样本，在双色荧光来自同一份样本，在双色荧光标记系统中，两种荧光标记同一标记系统中，两种荧光标记同一RNA，从理论上讲，从理论上讲，所有基因的信号比值应该为所有基因的信号比值应该为1，在散点图上形成一条，在散点图上形成一条斜率为斜率为1的直线。此方法已成为评价的直线。此方法已成为评价芯片试验体系芯片试验

25、体系的的一个重要的方式。一个重要的方式。自身比较实验自身比较实验l衡量筛选到的差异表达基因的可靠性衡量筛选到的差异表达基因的可靠性假阳性基因与假阳性率假阳性基因与假阳性率l自身比较实验，理论上不存在差异表达基因，但自身比较实验，理论上不存在差异表达基因，但实际上会检测到少量基因的实验组实际上会检测到少量基因的实验组/ /对照组比值超对照组比值超过阈值，这些即为过阈值，这些即为假阳性基因假阳性基因 。l阈值是人为设定的主观标准，以阈值为基础来判阈值是人为设定的主观标准，以阈值为基础来判断假阳性存在很大的主观性。断假阳性存在很大的主观性。l在特定的阈值下，假阳性率的大小可以反映出芯在特定的阈值下，

26、假阳性率的大小可以反映出芯片系统的误差情况，假阳性率高，则芯片数据误片系统的误差情况，假阳性率高，则芯片数据误差大。差大。l因此，假阳性率可以作为一个芯片平台的重要质因此，假阳性率可以作为一个芯片平台的重要质量指标。量指标。假阳性率越低，芯片平台的可靠性越高。假阳性率越低，芯片平台的可靠性越高。 假阳性产生的原因：假阳性产生的原因： 1 1）由随机误差引起：杂质、背景等因素）由随机误差引起：杂质、背景等因素2 2）在双荧光系统中，在双荧光系统中，Cy3Cy3和和Cy5Cy5两种染料对不同基因的两种染料对不同基因的掺入效率略有不同，掺入效率略有不同，会引入一部分的假阳性，这部分会引入一部分的假阳

27、性，这部分差异并不是随机的，与基因序列或信号强度都有一定差异并不是随机的，与基因序列或信号强度都有一定的关系。的关系。 这些假阳性只能通过这些假阳性只能通过染料互换（染料互换（Dye SwappingDye Swapping）标记）标记的重复实验的重复实验加以去除。只是染料的差异不大，因此，加以去除。只是染料的差异不大，因此，在很多研究中往往忽略。在很多研究中往往忽略。 假阴性产生原因假阴性产生原因1）系统误差：信号值的线性工作范围和背景的原因导致）系统误差：信号值的线性工作范围和背景的原因导致Cy3/Cy5的比值比实际的表达比值小的比值比实际的表达比值小2）表达差异倍数本身比较小，而人为的判

28、定阈值为）表达差异倍数本身比较小，而人为的判定阈值为0.5-2.0；3）弱信号导致的无效基因；）弱信号导致的无效基因；4）生物学样本的不纯，如病变组织中混有正常细胞导致）生物学样本的不纯，如病变组织中混有正常细胞导致Cy3/Cy5的比值比实际的表达比值小的比值比实际的表达比值小5）非特异性杂交导致的检测比值压缩，尤其是）非特异性杂交导致的检测比值压缩，尤其是cDNA芯片回芯片回导致更强的非特异性杂交；导致更强的非特异性杂交；6）基因芯片上一般并不覆盖所有的基因，样本中的一些阳性）基因芯片上一般并不覆盖所有的基因，样本中的一些阳性基因由于在芯片上没有对应的探针，从而不能探测出。基因由于在芯片上没

29、有对应的探针，从而不能探测出。基因芯片的数据一般不考虑假阴性问题，仅对阳性基因进行基因芯片的数据一般不考虑假阴性问题，仅对阳性基因进行分析和进一步研究。分析和进一步研究。 相关系数（相关系数（correlation coefficientcorrelation coefficient） lr r在在-1-1到到1 1之间。之间。l如果如果r r为为0 0表示完全不相关。表示完全不相关。r r等于等于1 1时为完全正时为完全正相关，等于相关，等于-1-1时为完全负相关。时为完全负相关。l相关系数用于衡量芯片的重复性有一定的参考相关系数用于衡量芯片的重复性有一定的参考价值价值 。cDNAcDNA芯

30、片中使用相关系数芯片中使用相关系数l衡量衡量同一张芯片中的两种荧光信号的重复性同一张芯片中的两种荧光信号的重复性：当：当Cy3Cy3和和Cy5Cy5信号信号值之间的相关系数接近值之间的相关系数接近1 1，表明两种荧光信号的相关程度非常高，表明两种荧光信号的相关程度非常高，从而证明双色荧光系统可靠性高；从而证明双色荧光系统可靠性高；l在两次重复实验中在两次重复实验中，得到两组，得到两组Cy5/Cy3Cy5/Cy3比值，计算两组比值之间比值，计算两组比值之间的相关系数，的相关系数，作为判断重复性的标准作为判断重复性的标准。理论上如果数据完全重。理论上如果数据完全重复，则其比值的相关系数为复，则其比

31、值的相关系数为1 1，但由于系统误差的存在，比值往，但由于系统误差的存在，比值往往小于往小于1 1，国际上没有公认的判断芯片数据重复性的标准，国际上没有公认的判断芯片数据重复性的标准，不同不同实验的实验的R R值相差很大，有人在特定实验中曾用比值的相关系数大值相差很大，有人在特定实验中曾用比值的相关系数大于于0.70.7作为判断重复实验成功的标准。作为判断重复实验成功的标准。 相关系数衡量重复性的局限性相关系数衡量重复性的局限性 l相关系数的大小不仅与芯片的重复性有关，还与两个比较样本之间的表相关系数的大小不仅与芯片的重复性有关，还与两个比较样本之间的表达差异程度有关，即当实验组和对照组两个样

32、本表达差异小、差异表达达差异程度有关，即当实验组和对照组两个样本表达差异小、差异表达基因的数量非常少时，相关系数很低。基因的数量非常少时，相关系数很低。l如果样本的真实差异基因很少，意味着绝大部分的基因是非差异表达基如果样本的真实差异基因很少，意味着绝大部分的基因是非差异表达基因，用相关系数评估就不适当因，用相关系数评估就不适当，容易错误地得出重复性不好的结论。，容易错误地得出重复性不好的结论。变异系数（变异系数（coefficient of variation, CVcoefficient of variation, CV） l当芯片数据重复较多时，可以用比值的变异系数来判断当芯片数据重复较

33、多时，可以用比值的变异系数来判断数数据的重复性据的重复性，好处在于屏蔽了样本的量纲和均数大小的影，好处在于屏蔽了样本的量纲和均数大小的影响。响。l计算每个基因比值的计算每个基因比值的CVCV值，用所有基因的平均值，用所有基因的平均CVCV值衡量整值衡量整张芯片实验的重复性。张芯片实验的重复性。CVCV值越小，表示重复性越好。值越小，表示重复性越好。l变异系数适合于衡量多组芯片的重复。变异系数适合于衡量多组芯片的重复。l变异系数的计算需要多组芯片的重复，涉及比较高昂的成变异系数的计算需要多组芯片的重复，涉及比较高昂的成本，所以本，所以这一指标主要用于芯片平台的测评这一指标主要用于芯片平台的测评。

34、l正式的实验一般重复做两、三次，就无法采用变异系数作正式的实验一般重复做两、三次，就无法采用变异系数作为衡量实验重复性的依据。为衡量实验重复性的依据。r1/r2r1/r2值值 1）r1/r2值是指两次重复实验比值相除2）从理论上讲同一个点（基因）的两次重复实验Ratio1/Ratio21，也就是说log2(r1/r2)应该是0。但由于误差的存在，r1/r2值往往偏离1，偏离程度越大，表明该点的重复性越差。3）r1/r2值作为筛选重复实验中的有效点的标准。通常当r1/r2值落在0.5-2区间时，认为是有效重复，而落在该区间外的点被认为重复性不好，可以作为无效点被过滤。4）用有效点的百分率作为衡量

35、整个芯片实验重复性的参数。落在有效区间内的点作为重复好的基因，这些有效点占总基因数的百分数即为有效点的百分率，百分率越高，重复越好。r1/r2r1/r2值不足值不足l当基因差异表达的倍数过大，使得两种荧光信号中有一个过强或过弱而落在线性工作范围之外，r1/r2值就会产生较大的误差，从而被过滤l一些低丰度基因，由于信号弱导致比值的波动大。比如某一个基因在两次实验中的比值分别为100和30，r1/r2为3.33，那么把这个点作为无效点剔除就不妥当，因为这个基因的两次实验都显示了上调表达。 第二节第二节 基因芯片弱信号处理基因芯片弱信号处理弱信号与噪声弱信号与噪声背景噪声背景噪声有生物意义的弱信号有

36、生物意义的弱信号分离开来非常重要分离开来非常重要 信信号号强强度度低低分离弱信号和噪音的方法分离弱信号和噪音的方法l1 1 重复芯片实验：缺点重复芯片实验：缺点成本较高，而且会成本较高，而且会提高芯片数据的复杂性。提高芯片数据的复杂性。l2 2 找到一个适当的阈值：低于该值的信号点认找到一个适当的阈值：低于该值的信号点认为是无意义点和不可靠点，应当滤除不进入后为是无意义点和不可靠点，应当滤除不进入后续数据分析；高于该值的信号点认为是一些真续数据分析；高于该值的信号点认为是一些真正的弱信号点和可靠点，应当进入后续的数据正的弱信号点和可靠点，应当进入后续的数据分析，挖掘出具有生物意义的信息。分析，

37、挖掘出具有生物意义的信息。 阈值确定方法阈值确定方法l固定值法：固定值法：设定一个固定阈值，小于这个阈值就设定一个固定阈值，小于这个阈值就是弱信号点。但每张芯片的特性并不一样，所以是弱信号点。但每张芯片的特性并不一样，所以用一个通用的值来区分信号过于绝对化。用一个通用的值来区分信号过于绝对化。l信噪比法：信噪比法：计算单个信号的信噪比来确定这个信计算单个信号的信噪比来确定这个信号是否是弱信号，但是弱信号点通常是信噪比较号是否是弱信号，但是弱信号点通常是信噪比较低的，所以用这种标准低的，所以用这种标准过于严格过于严格，很多有信息的，很多有信息的弱信号点将会失去。弱信号点将会失去。阈值确定方法阈值

38、确定方法l背景平均值加两倍方差：背景平均值加两倍方差：计算整个片子背景平均计算整个片子背景平均值加两倍方差作为阈值，但本底的波动则会导致值加两倍方差作为阈值，但本底的波动则会导致阈值的波动。阈值的波动。l阴性对照点平均信号值加两倍方差：阴性对照点阴性对照点平均信号值加两倍方差：阴性对照点平均信号值加两倍方差平均信号值加两倍方差作为阈值。有效的阴性对作为阈值。有效的阴性对照点是有限的，不足以形成正态分布；而且这种照点是有限的，不足以形成正态分布；而且这种方法易于受到阴性对照点自身的影响；有时由于方法易于受到阴性对照点自身的影响；有时由于点样针受到污染，或者同源杂交使得阴性对照点点样针受到污染，或

39、者同源杂交使得阴性对照点的信号强度值很高，这些都会使得最后得到的阈的信号强度值很高，这些都会使得最后得到的阈值波动较大。值波动较大。 利用强度累积分布函数确定弱信号阈值利用强度累积分布函数确定弱信号阈值 任何组织任何组织或细胞中都或细胞中都有一定比例有一定比例的不表达基的不表达基因，这些不因，这些不表达基因和表达基因和PCRPCR或杂交或杂交过程中失败过程中失败基因位于累基因位于累积分布函数积分布函数底部。底部。分离弱信号和噪声的阈值：分离弱信号和噪声的阈值：TD对数据进行对数转换对数据进行对数转换 l对数转换能够提供从生物学角度上易于解释和有意义的对数转换能够提供从生物学角度上易于解释和有意

40、义的数据。数据。l对数变换减弱了方差和平均值，使得表达的变化独立于对数变换减弱了方差和平均值，使得表达的变化独立于其产生的强度位置，在低强度值处的倍数改变与高强度其产生的强度位置，在低强度值处的倍数改变与高强度值处发生的倍数改变具有可比性。值处发生的倍数改变具有可比性。l对数转换后的数据的分布呈现出较好的对称性和正态性。对数转换后的数据的分布呈现出较好的对称性和正态性。一些常用的统计分析方法，如一些常用的统计分析方法，如t t检验、检验、F F检验、相关和回检验、相关和回归等方法都要求数据满足正态分布或近似正态分布。归等方法都要求数据满足正态分布或近似正态分布。l如果使用以如果使用以2 2为底

41、的对数，后续的分析和数据的解释将非为底的对数，后续的分析和数据的解释将非常方便。例如，要选择具有常方便。例如，要选择具有4 4倍以上变化的基因可以在比倍以上变化的基因可以在比值直方图的值直方图的log2(ratio)=2log2(ratio)=2处截取。处截取。 第三节第三节基因芯片数据归一化基因芯片数据归一化（normalization）数据的归一化数据的归一化l归一化：归一化：消除系统误差的影响，使得同一芯片上和不同消除系统误差的影响，使得同一芯片上和不同芯片间基因表达水平的直接比较无法实现。芯片间基因表达水平的直接比较无法实现。l芯片扫描的原始数据中，存在着各种偏差，在对芯片数芯片扫描的

42、原始数据中，存在着各种偏差，在对芯片数据进行分析之前，必须进行数据的校正据进行分析之前，必须进行数据的校正, ,才能使分析的才能使分析的结果真实地反映生物学功能。结果真实地反映生物学功能。双色荧光标记法所引起的系统变异双色荧光标记法所引起的系统变异 （1）荧光物质的物理、化学属性。）荧光物质的物理、化学属性。Cy3和和cy5光量子范围不同，光量子范围不同，cy5有时具有比有时具有比cy3更高的背景水平。更高的背景水平。（2）扫描仪的硬件设计可能对）扫描仪的硬件设计可能对cy3和和cy5具有不同的读取效率。具有不同的读取效率。（3）标记的方法。绝大多数）标记的方法。绝大多数cDNA微阵列都会引入

43、基因或序列微阵列都会引入基因或序列特异性偏倚。某些基因使用一种染料标记比使用另外一种染料特异性偏倚。某些基因使用一种染料标记比使用另外一种染料标记具有更强的荧光信号，并且这并非随机现象，而是在重复标记具有更强的荧光信号，并且这并非随机现象，而是在重复实验中稳定出现。理论上，在自身对照实验中所有基因的实验中稳定出现。理论上，在自身对照实验中所有基因的cy3/cy5应为应为1。由双色荧光标记所产生的系统偏倚导致在。由双色荧光标记所产生的系统偏倚导致在cy3和和cy5标记物具有相同的量时，它们的荧光强度并不相等。标记物具有相同的量时，它们的荧光强度并不相等。 系统误差的几种图形呈现方法系统误差的几种

44、图形呈现方法 l散点图散点图 箱式图：箱式图：可以在图形上对一组数据的均数、中位可以在图形上对一组数据的均数、中位数、上、下四份位数和最大、最小值进行显示，数、上、下四份位数和最大、最小值进行显示，直观地反映出数据的集中趋势和离散趋势。按照直观地反映出数据的集中趋势和离散趋势。按照某个分类变量进行分组的直方图可以对不同组的某个分类变量进行分组的直方图可以对不同组的数据分布情况进行直观的比较。数据分布情况进行直观的比较。 M-A 图图 X axis: A average intensity A = 0.5*log(Cy3*Cy5)Y axis: M log ratio M = log(Cy3/C

45、y5) 分布密度图分布密度图空间点图：芯片上的每一个点的数据都可以在该空间点图：芯片上的每一个点的数据都可以在该平面图上显示出来平面图上显示出来 数据的归一化步骤数据的归一化步骤l两个基本步骤：不变表达基因（非差异表达基两个基本步骤：不变表达基因（非差异表达基因）的选取以及校准方法。因）的选取以及校准方法。l不变表达基因不变表达基因：指表达水平在研究条件和对照：指表达水平在研究条件和对照条件下没有发生变化的基因。条件下没有发生变化的基因。不变表达基因的不变表达基因的选取对于成功的归一化和分析是非常重要的。选取对于成功的归一化和分析是非常重要的。 l校准方法：线性，非线性，稳健（降低奇异点校准方

46、法：线性，非线性，稳健（降低奇异点的影响），其他算法的影响），其他算法用于归一化的非差异表达基因选择用于归一化的非差异表达基因选择 l归一化的第一步是选择非差异表达基因或不变归一化的第一步是选择非差异表达基因或不变表达基因。表达基因。l全部基因全部基因 l管家基因管家基因 l对照基因对照基因l秩不变基因（秩不变基因（rank-invariant genesrank-invariant genes） 全部基因全部基因 l芯片上的绝大多数基因都是非差异表达的芯片上的绝大多数基因都是非差异表达的，仅有比例，仅有比例非常小的基因在两个非常小的基因在两个mRNAmRNA样品中的表达有差异，因为样品中的表

47、达有差异，因为根据生物学知识，若有很多基因的表达都发生了改变，根据生物学知识，若有很多基因的表达都发生了改变，这种改变对生物体来说将是致死的；上调和下调基因这种改变对生物体来说将是致死的；上调和下调基因的表达水平具有对称性。的表达水平具有对称性。l这种方法被成功应用于染色体规模的微阵列，芯片上这种方法被成功应用于染色体规模的微阵列，芯片上的基因数目很大，通常大于的基因数目很大，通常大于50005000，在各实验条件下具，在各实验条件下具有差异表达的基因数目不超过有差异表达的基因数目不超过1010。l但由于不同生物样品表达图谱通常具有较大的差异，但由于不同生物样品表达图谱通常具有较大的差异，因此

48、使用全部基因或绝大多数基因（对表达水平两端因此使用全部基因或绝大多数基因（对表达水平两端的数据进行截尾）进行归一化将导致在准确性方面受的数据进行截尾）进行归一化将导致在准确性方面受到一定程度的限制。到一定程度的限制。 管家基因管家基因l管家基因管家基因：在各种条件下具有稳定表达的基因。：在各种条件下具有稳定表达的基因。l在进行强度依存偏倚的归一化时，管家基因的荧在进行强度依存偏倚的归一化时，管家基因的荧光强度范围应该包含光强度范围应该包含芯片上所有点的荧光强度的芯片上所有点的荧光强度的整个范围整个范围，l这对管家基因来说存在一定的困难，因为管家基这对管家基因来说存在一定的困难，因为管家基因通常

49、是高表达基因，对应于高荧光强度的点，因通常是高表达基因，对应于高荧光强度的点，而在低的荧光强度下的管家基因较少。因此，当而在低的荧光强度下的管家基因较少。因此，当可以预先确定的管家基因的数量较少或管家基因可以预先确定的管家基因的数量较少或管家基因的强度不能覆盖信号强度的整个范围时，使用管的强度不能覆盖信号强度的整个范围时，使用管家基因进行非线性的归一化通常得不到较好的结家基因进行非线性的归一化通常得不到较好的结果。果。 管家基因管家基因l实际上，找出一组在各种实验条件下表达都不发实际上，找出一组在各种实验条件下表达都不发生改变的管家基因是非常困难的，但找到一组在生改变的管家基因是非常困难的，但

50、找到一组在特定实验条件下的特定实验条件下的“临时临时”管家基因还是可行的。管家基因还是可行的。l最近的研究表明管家基因的表达水平也会发生显最近的研究表明管家基因的表达水平也会发生显著的改变，因此使用管家基因对微阵列表达数据著的改变，因此使用管家基因对微阵列表达数据进行归一化有可能得到错误的结果。进行归一化有可能得到错误的结果。对照基因对照基因l使用外源性对照方法：来源于合成的使用外源性对照方法：来源于合成的DNADNA序列序列或者与实验生物不同的其他生物的或者与实验生物不同的其他生物的DNADNA，这些，这些对照序列理论上应当具有相同的红、绿荧光强对照序列理论上应当具有相同的红、绿荧光强度，可

51、以用于归一化。度，可以用于归一化。 l使用滴定系列方法：含有相同的基因或使用滴定系列方法：含有相同的基因或ESTEST，但不同浓度的点被点样在芯片上。理论上，在但不同浓度的点被点样在芯片上。理论上，在强度的整个范围内这些点都具有相同的红、绿强度的整个范围内这些点都具有相同的红、绿荧光强度值。荧光强度值。对照基因对照基因常用于滴定系列的常用于滴定系列的DNADNA有两种：有两种：1 1）染色体）染色体DNADNA：在各种条件下都具有恒定的表达：在各种条件下都具有恒定的表达水平，因此可以用于滴定序列，但染色体水平，因此可以用于滴定序列，但染色体DNADNA太太复杂。复杂。2 2）特定设计的微阵列样

52、本池（）特定设计的微阵列样本池（MSPMSP，microarray microarray sample poolsample pool）：它包含了微阵列上的所有基因，）：它包含了微阵列上的所有基因，类似于没有中间插入序列的染色体类似于没有中间插入序列的染色体DNADNA，从而为，从而为标记标记cDNAcDNA上的每个片断提供潜在的探针，因此上的每个片断提供潜在的探针，因此在不同的生物学样品间具有较恒定的表达。在不同的生物学样品间具有较恒定的表达。对照基因对照基因lMSPMSP作为归一化的对照基因满足两个条件：作为归一化的对照基因满足两个条件：（1 1）在不同生物学样品间具有恒定的表达，具）在不

53、同生物学样品间具有恒定的表达，具有最小的样本特异性偏倚有最小的样本特异性偏倚（2 2）强度范围包含整个芯片上点的强度范围。）强度范围包含整个芯片上点的强度范围。l由于由于MSPMSP构建方面的挑战性，得到非常高强度构建方面的挑战性，得到非常高强度的表达还存在一定的困难。实际应用中，通常的表达还存在一定的困难。实际应用中，通常在在MSPMSP中加入高表达基因来解决。中加入高表达基因来解决。 秩不变基因（秩不变基因（rank-invariant genesrank-invariant genes） l如果芯片上没有外部对照如果芯片上没有外部对照DNADNA，没有关于哪些基因为，没有关于哪些基因为差

54、异表达基因，哪些基因为非差异表达基因，及有差异表达基因，哪些基因为非差异表达基因，及有多少基因的表达发生了显著性变化的先验知识，非多少基因的表达发生了显著性变化的先验知识，非差异表达基因的选择差异表达基因的选择只能依靠数学的方法来只能依靠数学的方法来实现。实现。l对一张芯片上所有点的整体荧光强度值按照从小到对一张芯片上所有点的整体荧光强度值按照从小到大的顺序进行排序，每个点的序次称为该点的大的顺序进行排序，每个点的序次称为该点的秩秩。l秩不变基因：秩不变基因：在同一张芯片上红、绿强度的秩相同在同一张芯片上红、绿强度的秩相同或非常接近的基因。或非常接近的基因。归一化方法归一化方法lGlobal

55、normalization (Scaling)全局归一法全局归一法（缩放法）（缩放法）lIntensity-dependent normalization局部加局部加权归一化法权归一化法lQuantile Normalization分位数归一化法分位数归一化法Global normalization全局归一化全局归一化l单张芯片单张芯片全局归一化：建立在一定的假定基础上：全局归一化：建立在一定的假定基础上：红红- -绿偏移在整个序列上是常数，即红、绿强度是通绿偏移在整个序列上是常数，即红、绿强度是通过常数因子相关联，过常数因子相关联， R=k R=k* *G G。全局归一化的目标就。全局归一化

56、的目标就是估计此常数因子是估计此常数因子 k k，通过减去，通过减去c c对比值进行校正，对比值进行校正，使得非差异表达基因的强度比为使得非差异表达基因的强度比为1 1，即把对数比的中，即把对数比的中心移到心移到0 0。一般计算方法取芯片上。一般计算方法取芯片上所有对数比数值的所有对数比数值的均数或中位数均数或中位数。l多张芯片全局归一化：多张芯片全局归一化： Xinorm = k*Xi (k:(k:校正因子校正因子) )。一般计算方法取一般计算方法取某一张某一张芯片上所有对数比数值的均芯片上所有对数比数值的均数或中位数。数或中位数。单张芯片双通道校正效果单张芯片双通道校正效果 BeforeA

57、fter单张芯片双通道校正效果单张芯片双通道校正效果 多张芯片校正效果多张芯片校正效果 Intensity-dependent normalizationl比值与强度相关（或者说比值对于点的荧光强度存在系统比值与强度相关（或者说比值对于点的荧光强度存在系统依存性）而全局归一化方法不能解决此强度依存偏倚。依存性）而全局归一化方法不能解决此强度依存偏倚。l局部加权线性回归和其它稳健的线性回归方法局部加权线性回归和其它稳健的线性回归方法可以用于消可以用于消除强度依存效应的作用。除强度依存效应的作用。l模型建立后，将被用于对数据进行校正：每个数据点的垂模型建立后，将被用于对数据进行校正：每个数据点的垂

58、直坐标直坐标M M值减去拟合的指数曲线所确定的值，使得染色的值减去拟合的指数曲线所确定的值，使得染色的偏倚得以校正。偏倚得以校正。l染色所造成的偏倚在染色所造成的偏倚在MAMA图中常呈指数型分布，因此可图中常呈指数型分布，因此可以基于实验数据拟合指数函数的参数。以基于实验数据拟合指数函数的参数。l由于微阵列通常包含大量的数据点，通常不对原始的由于微阵列通常包含大量的数据点，通常不对原始的所有数据拟合模型，而是采用更为简便的处理方法，所有数据拟合模型，而是采用更为简便的处理方法，在散点图中把水平在散点图中把水平X X轴划分为若干强度区间，相当于轴划分为若干强度区间，相当于把图形分割成对应把图形分

59、割成对应X X轴不同区间的若干竖条，计算每轴不同区间的若干竖条，计算每个区间内数据点的重心，对所有的重心数据点拟合形个区间内数据点的重心，对所有的重心数据点拟合形如如y=a+bexp(-cx)y=a+bexp(-cx)的指数曲线，目的是得到能够呈的指数曲线，目的是得到能够呈现数据中染色偏倚的指数曲线参数的最佳组合。现数据中染色偏倚的指数曲线参数的最佳组合。局部加权线性回归局部加权线性回归llocally weighted scatter plot smoothlocally weighted scatter plot smooth，简写为，简写为 LOWESSLOWESS和和LOESSLOES

60、S。两种方法都使用局部加权线性回归对。两种方法都使用局部加权线性回归对数据进行平滑。数据进行平滑。l平滑过程是在局部进行的，每个平滑值是由给定点临近平滑过程是在局部进行的，每个平滑值是由给定点临近一定范围内所有的数据点决定的；平滑过程是通过加权一定范围内所有的数据点决定的；平滑过程是通过加权实现的，给定数据点一定范围内的数据点是通过加权回实现的，给定数据点一定范围内的数据点是通过加权回归建立起来的，距离给定数据点不同距离的数据在建立归建立起来的，距离给定数据点不同距离的数据在建立局部回归方程时的权重不同。局部回归方程时的权重不同。lLOWESSLOWESS和和LOESSLOESS两种方法的区别