目基因筛选与DNA文库构建

1、目的基因的获得1.基因文库（gene library）；2.从物种的基因组或cDNA中PCR 扩增；3. 人工合成基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因 基因文库（Gene library）： 由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。 一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 即 Genomic library 基因组 DNA 文库： 指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 按照外源DNA的片段：基

2、因组 DNA 文库和cDNA文库 包含基因的全部信息，如编码区，非编码区，内含子和外显子、启动子及调控序列cDNA文库: complementary DNA 互补DNA 由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库。 反映了基因表达普，对研究基因表达，调控及基因互作非常有用。基因组 DNA 文库的构建程序：1、载体的制备；2、高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取；3、HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size sel

3、ection）；4、载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；5、重组克隆的挑取和保存。 构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。 文库的代表性和随机性代表性 文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。 采用酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等； 增加文库总容量。外源片段大小和重组克隆数量1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f)n: 一

4、个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值哺乳动物 3109kb若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3109 n=690773.2E.coli 4，639，221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9 p=99% f=10kb/4600kb n=2116一、用于构建基因文库的载体第一节 基因组DNA文库的构建可装载的外源DNAPlasmid 10kb Phage 0-23kbCosmid 45kbBAC 100kbYAC 300kb-1.2Mb 粘粒克隆所需的克隆子数是p

5、hage的一半，如需700000时，cosmid需350000个。 噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点； 经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过 100kb 以上的外源片段。YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段BAC 可减少DNA分子间的重组置换型载体coscosRLCentral stuffer1 phage vectors 目前用EMBL系列, 2001，DASH， Charon 38-40，GEM-11 等置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb有利于分子杂交进行筛选 43kb ，左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb

6、、 9kb 和 14kb 。克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。2Cosmid vector（柯斯质粒） 由噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因 所有cosmid vector均可用于构建文库。cos序列：噬菌体DNA的包装序列T4噬菌体DNA连接酶多连体分子二、用phage构建文库1总DNA的提取DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb（cosmid200kb） 2载体臂的制备 购买 载体制备、纯化 限制酶消化 BamHI / EMBL XhoI / GEM-11载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖 或NaCl） 梯度离心的收

7、获量大，而agarose回收量小 回收无填充片段 聚乙二醇沉淀，除去碎片置换型载体coscosRLCentral stuffer3基因组DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收20-24kb （ agarose法 or 梯度离心） 有些载体可做不完全补平4连接/包装 连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4 6个月稳定）5扩增和保存重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选6在宿主菌上形成噬菌斑7带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析 载体的去磷酸化，提高连接和包装效率 双酶切

8、消化载体 （EMBL系列，2001，XDASH，Charson 40,35,34）EMBL 3A: SalI BamHI EcoRI - E1 B1-S1 连接反应中，应测定外源片段与载体的比例 phage 108pfu/g DNA若用BamHI和EcoRI双酶切，可用异丙醇沉淀或其它柱层析法去除小片段，使非重组体的数目降低2个数量级，结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级 基因组DNA片段3凹端的不完全补平-GATC-CTAG- GATC-CTAG -Sau3AI-GA GATC-CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCT

9、P /dTTP-CTC TCGAG-GAGCT CTC-互补GEM-11基因组DNAVector 三、重组体的筛选和分析 噬斑原位杂交将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物基因组复杂度为3109bp，必须筛选几十万个噬斑平皿直径 (mm)总面积(cm2)底层琼脂量 (ml)指示细菌量 (ml)顶层琼脂量 （ ml）噬 斑 最 大 数 目(噬 斑 数 /平 板 )9063.9300.12.515000150176.7800.36.550000不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目. 杂交筛选 用探针. 纯化. 分析 /Southern杂交，酶切S

10、equencing/ 其它方法，如免疫学方法四、亚基因组文库的构建用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库质粒 DNA，线粒体DNA, 特定限制性片段在有杂交探针的情况下，可通过Southern杂交，先找出目标基因所在的限制性片段的大小，然后用相应大小的限制性DNA片段构建出基因文库，这样可减少筛选的压力。例如 将基因组DNA用多种限制性内切酶切割， 通过Southern杂交 则 将SpeI切割的基因组DNA中的8.3kb片段回收，用于构建DNA文库发现目标基因在8.3kb SpeI片段上哺乳动物 3109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2E.coli 4639221bp

11、p=99% 平均10kb n=2134若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段, 则 n = 69075 若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段(10kb)， 则 n = 199 一、cDNA克隆用的mRNA第二节 cDNA文库的构建1. mRNA的完整性 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10100kDa蛋白 指导合成目的多肽的能力 利用免疫沉淀和SDS-PAGE mRNA的大小 500bp8kb 大部分 1.52kb 总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力 合成的cDNA也应为上述范围 脱氧胸苷酸12-18聚体ol

12、igo(dT) 12-18 引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至少增加30倍2mRNA的丰度 高丰度mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白 在特定细胞中占50-90% 低丰度mRNA0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA文库应足够大，鉴定和分离困难3mRNA的富集 按大小对mRNA进行分级分离 分离不同大小的mRNA（先变性，如氢氧化甲基汞，后梯度离心，蔗糖） 体外翻译，检测每份中的比活 cDNA的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA, agarose分离大小易辩 多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体 免疫亲和柱/A蛋白-Sepha

13、rose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo(dT)层析分离mRNA。 此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05% 并非都可用，根据材料来源特异性来选择 反转录酶 AMV (42) M-MuLV (37) RNase H RNase H弱 长mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求浓度高 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 RNase 抑制剂AAAAAAAmRNA53TTTTTTTT二、cDNA第一链的合成cDNA1自身引导法三、cDNA第二链的合成2. 置换合成法 有效 无须进

14、一步纯化 不需用S1酶，否则会导致cDNA的大量损失问题： 如何脱帽以便进入载体 5端cDNA不能合成（少几个Nt） 有可能仍形成发夹结构3. 第二链引导合成Okayama-Berg方法4. 引物-衔接头合成法四、ds cDNA的分子克隆1.同聚物加尾问题： 只对质粒有效，文库不易保存和复制。 尾的长短不一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。2合成接头和衔接头cDNA合成接头(含酶切位点)酶切NotI, SalI与载体连接Optional: methylation 接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100k

15、b一次)先甲基化ds cDNA，再连接接头用衔接头替换接头用衔接头替换接头3. 其他方法(1) mRNA-cDNA杂交体克隆mRNAcDNAAAAAAAAARNA 末端加尾效率只及DNA的1/10合成第一链后, 加尾, 与带dT尾的载体退火, 在宿主体内, 可除去RNA, 代之以DNA优点: 无须合成第二链, 序列完整 但效率 1/10(2) 依次连加不同接头(3) RACE random amplification of cDNA ends cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆 筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆， 而RACE可产生大量独立克隆mR

16、NAcDNATTTTTTTT-QI-QOAAAAAAAA. 经典RACE3末端克隆TTTTTTTT-QI-QO反转录QOPCRGSP1QIGSP2根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物 GSP1和GSP2PCRcDNA克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法获得3末端和5末端的序列5末端克隆mRNAAAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2- TTTTTTQ1/ GSP1 PCR反转录Q2/ GSP2 PCRGSP2获得的cDNA 克隆片段AAAAAAAGSP1反转录连接RNA寡聚物NNNNNNNNB. 新RACE(4) 其他与cDNA第二链合成有关的方法，如 Okayama

17、-Berg方法和引物-衔接头合成法五、cDNA克隆用的载体1gt10和gt11gt10: 可用核酸探针 克隆0-6kb EcoRI 插入后载体变cI- cI+在hflA中发生溶原GenBank: U02447gt11：表达载体，可用免疫探针 克隆0-7.2kb 可表达融合蛋白LacZE.coli C600 allowing growth of parental and recombinant phageC600hfl represses parental phage growth 50-100-fold, recombinant phage form clear plaques and par

18、ental phage form turbid plaquesE.coli LE392 allowing growth of parental and recombinant phageY1090 as the host, 42C形成噬斑适合用免疫学探针筛选2. ORF8 9kb 可用于定向克隆3其它gt18，19，20，21，22，23，ZAP第三节 基因克隆的策略基因克隆的本质从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”常见筛选工具: 探针狭义: 核酸, 抗体广义: 还包括其他筛选手段 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活性一、功能筛选 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 功能活

19、性：杀虫，酶 启动子/复制子利用目标基因的特定功能进行筛选Amp ori MCSTet gene without promoterVector 将目标DAN切割成小片段, 插入MCS在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter其他标记: gfp, Kan质粒复制单位的克隆Amp ori MCS目标宿主可用的抗性gene 将目标DAN切割成小片段, 插入MCS在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位 功能缺失在获得相应突变体的前提下以此突变体作为宿主在野生型的DNA导入后检测回复突变如 营养缺陷型 相关的基因二、核酸探针 同源DNA探针高度保守的基因 rRNA基因邻近种属的相应基

20、因相应基因的序列比较 合成寡核苷酸蛋白质N-末端aa序列简并探针degeneracy选取简并程度低的aa序列 综合合成可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交三、免疫在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选四、高表达基因高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数五(1)、差别杂交五(2)、扣除杂交T cell (TCR)B cell mRNAmRNAcDNAcDNA: mRNA 杂交体过量通过羟基磷灰石柱, 吸附杂交分子T cell (TCR

21、)特异的cDNA 流出cDNA 第二链合成生物素标记生物素结合蛋白柱六、mRNA差别显示mRNA 3末端 有12中可能的序列 以此12种引物引导cDNA第一链合成引物: 5-T11MN 或5-T12MN M=A, G, or C 以10核苷酸随机引物引导cDNA第二链合成(PCR) 可产生50-100条100-500bp DNA条带 12种锚定引物和20种随机引导组成240组引物, 产生约20000 DNA条带Sequencing gel对两个相近品种的mRNA作上述处理, 比较它们产生DNA扩增条带的差异, 找到 单方具有的特异DNA条带, 则可能找到特异性表达的基因, 回收并克隆特异性的条

22、带, 分析其序列, 以此条带为探针克隆全长基因。七、酵母双杂交系统用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质基因GAL4蛋白： 酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录 GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa 融合蛋白：DNA-BD域 / X蛋白X蛋白与靶蛋白Y 可发生作用构建融合表达文库AD域 / cDNAhost当文库中的某个重组子装载有蛋白Y的cDNA时，可能启动LacZ(HIS)报告基因的表达 Invitrogen Hybrid Hunter 五、其它 Tn插入缺失 分子标记（略）六、PCR在cDNA克隆中的应用1. RACE 等获得的cDNA 克隆片段, 并补平末端2、cDNA第二链的扩增CCCCAAAATTTTT-mRNAAAAATTTTT-CCCCAAAA-TTTTT-GGGGPCR扩增出ds cDNA加入合成的引物mRNAmRNA-CCCCAAAA-TTTTT-GGGG用合成的引物 合成cDNA第一链, 加入polyC尾3. PCR-Select cDNA Subtraction Cl