基因工程复习要点

1、基因工程复习要点1】基因工程(gene engineering):就是对不同生物的遗传物质，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。 2】广义的概念：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建, 即重组DNA技术。下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。3】基因工程四大要素：供体基因、载体、工具酶、受体细胞 4】理论上的三大发现：证明了生物的

2、遗传物质是DNA （基因工程的先导）、DNA的双螺旋结构和半保留复制机理、遗传信息的传递方式（中心法则）5】技术上的三大发现：限制性内切酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）、DNA连接酶的发现、载体的使用6】基因诊断：利用重组DNA技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷，因而比传统的诊断手段更加可靠。7】基因探针技术：利用DNA碱基互补的原理，用已知的带有标记的DNA通过核酸杂交的方法检测未知的基因。8】基因治疗（gene therapy）：将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。9】基因克隆的工具酶（instrum

3、ental enzyme of gene cloning）：应用于基因克隆中的各种酶的总称。10】核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase），从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease），从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）11】限制性核酸内切酶(restriction enzyme) ：一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。(寄

4、主控制与修饰现象P13)12】I型酶：要求有特定的识别序列，但切点在序列以外的不远处II型酶：蛋白质结构最简单，最常用。能识别专一的核苷酸序列，不兼有甲基化酶的活性，细胞内另有独立的甲基化酶，切点严格，而且就在识别序列之中。II 型限制性核酸内切酶的基本特性：在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的。断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端、识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列、大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧、识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。（EcoRI等产生的5粘性

5、末端、PstI等产生的3粘性末端、PvuII等产生的平头末端）III型酶：有专一的识别序列，距离是严格的。IV型酶：只切割碱基已被甲基化、羟甲基化或葡糖-羟甲基化的DNA序列。13】限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株EcoR大肠杆菌 RY13之酶、Hind嗜血流感杆菌Rd之酶、Alu藤黄节杆菌 之酶、Hae埃及嗜血菌之酶命名法：属名（大写，斜体）、种名（小写，斜体）、株名（正体）eg:Hind III=H in d 14】同裂酶(isochizomer):也叫同切点酶，异源同工酶，这类酶识别相同的序列，但是切割点不一定在同一

6、点上。15】同尾酶(isocaudamer)：是一类来源不同中，识别序列也不同，但对DNA切割所产生的粘性末端相同的一类酶。16】杂种位点一般不能被原来的任何一种同尾酶所识别。17】限制片段末端的连接作用有两种类型：分子间的连接：不同的DNA片段通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来 分子内的连接：由同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。18】1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 g 标准DNA所需的酶量19】影响核酸内切限制酶活性的因素 ：DNA的纯度（加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶、加大反应总体积、延长反应时间）D

7、NA样品的甲基化程度酶切消化反应温度，大多数酶标准反应温度都是37。DNA的分子结构核酸内切限制酶的缓冲液，核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸），ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。BSA的作用酶保护剂，在反应中保证酶具有最佳的活性。20】星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性现象 21】DNA连接酶：依据反应时所需能量辅助因子的不同分为两类：一类是依赖ATP的DNA连接酶；一类

8、是依赖NDA+的DNA连接酶。依据其来源可分为三类：T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶和热稳定DNA连接酶22】用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：由Ecoli染色体编码的DNA连接酶（用NAD+作能源辅助因子）、由Ecoli T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶（ATP作能源辅助因子）23】1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 g DNA（Hind III片段）所需的酶量24】黏性末端：是指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。25】平

9、末端：限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割形成的片段末端。26】平末端DNA片段的连接操作 提高平末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）；加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用；加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM27】克隆位点（MCS）：含有多种单一限制性内切酶的识别位点。TA载体：线性，两端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶。Cos位点：即黏性末端位点。28】平末端DNA片段连接法：直接连接（效率低）、同聚物加尾法（末端核苷酸转移酶）、衔接物连接法（形成黏性末端，linker:衔接物）

10、、接头分子连接法（使用T4 PNP多核苷酸激酶、碱性磷酸酶,adapter:接头）主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法 同聚加尾法：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。bp表示一个碱基对衔接物（linker）：指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 DNA接头：是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。29】DNA聚合酶DNA-pol：功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。30】噬菌体分为三个区：左臂、右臂、中间区31】

11、自主复制序列需要：端粒；复制起始位点；着丝粒；合适的选择标记32】Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con、Ori四个功能区。33】Klenow片段的用途：a 补齐DNA 3隐缩未端、b 标记DNA片段未端、c cDNA合成第二链 、d DNA测序（Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶）34】切口平移（缺口转移）（nick translation）当外切酶活性从缺口的5端移去一个5核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3端补上一个新的核苷酸。5端的核苷酸不断地被移去，3端的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。35】T4-DNA聚合酶基本特征：5

12、3的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性;在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切，在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。36】T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,DNA片段的同位素末端标记37】依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链;双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链38】作用于单链的外切核酸酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+。大肠杆菌核酸外切酶包括两个亚基组成单位，它们分别为xseA和xseB基因的编码产物。它

13、能够从5-末端或3-末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段。39】作用于单链的外切核酸酶：核酸外切酶由大肠杆菌xthA基因编码的单体蛋白质。主要活性:按3 5的方向催化双链DNA自3-OH末端释放5-单核苷酸 40】核酸外切酶（exo）:最初是从感染了噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5单核苷酸，但它不能降解5-OH末端。用途：将双链DNA转变成单链的DNA，供双脱氧法进行DNA序列分析使用；从双链DNA中移去5突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。41】单链核酸内切酶 ：S1核酸酶需要低水平的Zn2+离子，最适pH值4.04.3

14、。主要功能：催化RNA和单链DNA分子降解成为5单核苷酸；作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子。 42】Bal31核酸酶既具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性 主要用途包括：诱发DNA发生缺失突变；定位测定DNA片段中限制位点的分布；研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构43】核酸修饰酶：TdT：末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶。一般从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白。在它的催化下，将脱氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端，伴随无机磷酸的释放。44】碱性磷酸酶有两种来源：一是来源于大肠杆菌，叫做细菌碱性磷酸酶（B

15、AP）;二是来源于小牛肠，叫做小牛肠碱性磷酸酶（CIP）45】T4多核苷酸激酶(T4-PNP )基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷46】载体(Vector):在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(载体的本质是DNA)。常用的主要载体有：质粒(Plasmid)（主要指人工构建的质粒），噬菌体载体 ，柯斯质粒 (cosmid)、单链DNA噬菌体M13、动物病毒、人工染色体 (artificial chromosome)47】卸甲载体：将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移

16、所必需的25个碱基序列，构成的载体称为卸甲载体。48】载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。49】载体必须满足的条件：具有对受主细胞的可转移性，能在宿主细胞内自主复制，具有多克隆位点，具有合适的选择性标记。50】载体按功能分为：克隆载体（cloning vector）：对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可。表达载体（expression vector）：使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子。穿梭载体（shuttle vector）：可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表

17、达。51】质粒Plasmid：是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106108D，可自身复制和表达。52】基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：复制基因、选择性记、克隆位点。 53】质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制54】质粒DNA的构型：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈现超螺旋的SC构型；有一条DNA链出现有一至数个缺口，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型 ；线性分子DNA（IDNA），称为L构型 55】质粒的基本性质：1、质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。根据拷贝数，质粒可分为两大复制类型

18、：严紧型质粒（stringent plasmid）在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1数个拷贝，松弛型质粒（relaxed plasmid）在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上。多拷贝质粒的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响2、质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。3、质粒DNA的转移：G细菌质粒可分为两类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）如F、Col、R质粒等。非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用56】F质粒：大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子或性因子决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F，相当于雄性。不含这种致育

19、因子F的品系记为F，相当于雌性。 R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。柯斯质粒（cosmid）是一类由人工构建的含有 DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning） 57】按其用途可将标记基因分为：选择标记基因用于鉴别目标

20、 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因可用于将特殊表型的重组子挑选出来，筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒。 58】在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。59】天然质粒：一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质

21、粒。60】重组质粒当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。 61】乳糖操纵子（lac operon）大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 -半乳糖苷酶（-galactosidase），如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。 底物X-gal被-半乳糖苷酶分解后可产生蓝色产物，可使菌落或噬菌斑呈蓝色。即产物表达呈蓝色，未表达呈无色。【lacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。 lacZ：只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基

22、因 ，其产物也没有酶学活性。当这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 -半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。在 lacZ编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。 底物 X-gal 还可充作生色剂，被 -半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。（此处为重点要理解记忆！)】62】插入失活：外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertional inactivation)。63】质粒DNA的分离纯化：氯

23、化铯密度梯度离心法 碱溶法 沸水浴法 64】RNA干扰：双链RNA对基因表达的阻断作用。根据dsRNA来源的不同，RNAi可分为转基因RNAi和病毒介导的基因沉默（VIGS）两种方法，使用不同的载体。65】基因沉默：是利用植物体天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将內源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。66】VIGS技术最早的载体是以烟草花叶病毒（TMV）或马铃薯病毒X（PVX）为基础，但是，应用最成功的是烟草脆裂病病毒（TRV

24、）67】RNAi表达框架（SECs）：由启动子、siRNA正义链模板、间隔区、siRNA反义链模板和终止子构成。动物细胞一般采用polIII启动子68】质粒载体必须具备的基本条件：具有复制起点、具有抗菌素抗生基因、具若干限制酶单一识别位点、具有较小的分子量和较高的拷贝数69】重要的大肠杆菌质粒载体：1、pBR322质粒载体组成部分：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、质粒pMB1的DNA复制起点（ori） 优点:具有较小的分子量；具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号；具有较高的拷贝数；2、pUC质粒载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一

25、段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 特点：来自pBR322质粒的复制起点（ori）；氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。3、T载体：一个线性含3-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。 70】克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功

26、能，在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。71】病毒（virus）是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞（转导）,然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。作为载体的原因：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增黏性质粒载体：含有 噬菌体DNA的某些位点并被包装而获得的载体72】M13：小分子的丝状单链噬菌体73】The phage cos ends： cos位点（cohesive-end site，粘性末端位点 ）在噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个

27、核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。74】噬菌体将基因组分为三个区：左臂、右臂、中间区溶原状态：噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 75】噬菌体载体构建时插入选择性标记基因：lacZ 基因、c基因失活（c是噬菌体的抑制基因，高频溶源化（hfl）的 E.coli 中，c 的表达使 噬菌体进入溶源状态）、Spi 筛选76】噬菌体载体分为两类：插入型载体（insertion vectors）只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。替换型载体又叫做取代型载体（sub

28、stitution vector一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。77】转染（transfection）用重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染。转染效率：每微克DNA转染产生的噬菌斑数目78】末端酶（terminase）或Ter体系：噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system）。发生作用的条件：DNA分子具有两个cos位点，两个cos位点之间的距离3854kb79】Ti 质粒几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的

29、根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（Agrobacterium.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti介导的.可分为T-DNA、Vir、Con、Ori四个功能区。Ti质粒的表达载体：一元载体是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体通过同源重组所产生的一种复合性载体。双元载体是指由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变 Ti质粒构成的系统。80】常用的人造染色体载体：酵母人工染色体载体YAC在酵母中复制的必需元件包括：自主复制序列、着丝粒、两个端粒。细菌人工染色体BAC81】核酸的提取与纯化：82】基因组DNA的提取

30、的方法：1、浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离、2、有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用、3、密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物、4、CTAB法、5、酚抽提法、6、SDS法（SDS可使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶活性）83】碱裂解法提取质粒DNA原理：环状的双链质粒DNA在强碱作用下变性成单链DNA，两条闭合环状的质粒DNA在中性条件可复性成DNA双链。步骤 ：悬浮菌体破膜、蛋白质和DNA变性中和离心除去沉淀纯化DNA沉淀DNA（乙醇）84】DNA提取常见问题：1、DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应

31、原因：DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质；DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应；DNA中残留有金属离子2、DNA降解的 原因：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断、外源核酸酶污染、反复冻融。3、DNA提取量少 原因实验材料不佳或量少、破壁或裂解不充分、沉淀不完全、洗涤时DNA丢失85】RNA的提取与纯化：异硫氰酸胍/苯酚法 原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净

32、RNA。离心分离法 86】影响RNA提取的因素：材料、样品破碎及裂解、纯化、87】核酸的纯度与浓度鉴定：紫外分光光度法（只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液）、荧光光度法88】断核酸样品的纯度：DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0， < 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染DNA或RNA的定量，OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA、40g/ml单链DNA（或RNA）、20g/ml寡核苷酸89】核酸的保存DNA的储存1、短期贮存：4或-20存放于TE

33、（tris和EDTA）缓冲液中。2、长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；RNA的储存：RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。90】核酸电泳分成两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳91】DNA电泳影响主要因素：DNA分子特性和电泳条件（DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢；DNA分子构型； 对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢；电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄（5V/cm）；溴化乙锭 （ EB ）92】DNA电泳上样缓冲液 （loading buffer）：10mmol/l的EDTA螯合Mg 2，防止电泳过程中DNA被降解、一定浓度的甘油或

34、蔗糖、溴酚蓝指示剂93】DNA完整性的测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳的结果可判定核酸制品的完整性，若降解，电泳图呈拖尾状94】RNA完整性的测定：完整或降解很少的RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，迁移率高，荧光强度积分低。95】分子杂交(molecular hybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P或125I)、生物素或荧光酶等）探针（DNA、RNA或蛋白质）进行相同或不同种类分子间相互特异识别而发生结合的过程.Southern 杂交(Southern blotting )、Nort

35、hern 杂交(Northern blotting )、Western 印迹法(Western blotting)、噬菌斑杂交。96】探针（probe）：一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。97】通常用-进行标记，因为会被切除。98】寡核苷酸探针（oligonucleotid probe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA或RNA分子的存在。常用的标记物为放射性同位素标记： 32P、 33P、 35S，非

36、放射ABC性标记：生物素、地高辛99】探针的标记方法：末端标记法、切口平移法、引物延伸法、体外转录法100】杂交探针的标记：ABC荧光标记；ABC显色酶标记（加入生物素：蓝色；加入过氧化氢酶：棕褐色）；地高辛系统标记（地高辛甾醇半抗原：digoxigenin DIG）.(为非放射性检测)101】原位杂交(in situ hybridization)：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。102】菌落或噬菌斑杂交:将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。103】聚合酶链反应(Polymerase Chai

37、n Reaction, PCR)利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外扩增的一种方法。104】基本过程包括：变性、退火、延伸。105】反应最终的DNA 扩增量Y：Y(1X)n代表DNA片段扩增后的拷贝数，X：表示平均每次的扩增效率n：代表循环次数106】平台效应：随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应107】PCR反应的基本成分：引物、酶(热稳定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液 108】高保真酶：特点35核酸外切酶活性，降低碱基错配率。用途：表达基因

38、的克隆、基因的定点突变、细胞内基因点突变分析（SNP）109】引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度110】设计引物的原则：1、引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于 38 个碱基；2、引物扩增跨度：以500bp为宜；3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜；4、避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带；5、引物 3端的碱基要求严格配对；6、引物中有或能加上合适的酶切位点；7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性8、引物量：每条引物的浓度0.1 1u

39、mol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好9、引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5 111】设计引物的操作流程：序列下载同源性比较引物设计筛选112】DNA序列的测定：双脱氧法测序 化学法测序113】DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。114】PCR产物的连接：1.在引物的5端设计酶切位点（3端1520bp与模板互补； 5端内切酶识别序列保护碱基）2. 与T载体直接连接115】耐热的DNA聚合酶:（1）Taq DNA聚合酶（保真度低于pfu，但扩增效率较高）、（2）Tth DNA聚合酶、（3）Vent DNA聚

40、合酶、（4）Pfu DNA聚合酶（保真度最高，碱基错配率最低）、（5）Pwo DNA聚合酶116】荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。117】实时定量PCR技术:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。118】实时荧光定量PCR计算步骤:临界点选择、临界点循环数、标准曲线绘制119】DNA序列分析:MaxamGilbert化学降解法、Sanger双脱氧链终止法120】根据大肠杆菌对密码子的利用率（密码子的偏好性）来选择核苷酸最少的序列。121】3'端好扩增，

41、因为有一个poly尾122】Gateway 载体构建系统：l噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。包括BP和LR反应。123】attB和attP位点可发生重组反应，产生attL位点和attR位点124】溶源途径的重组蛋白是由噬菌体整合酶以及大肠杆菌整合宿主因子蛋白组成，这两种酶的混合物称之为BP克隆酶混合物，而裂解途径的重组蛋白是由噬菌体整合酶、切除酶以及大肠杆菌整合宿主因子蛋白组成，这三种酶的混合物称之为LR克隆酶混合物。125】重组体导入受体细胞的方法：转化（transformation）（大肠杆菌捕获质粒DNA的过程）、转导（借助噬菌体把外源DNA导入细菌的

42、过程）和转染（transfection）（受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程)126】转化：热激法（制备感受态细胞）和电转化法（不需要制备特殊的感受态细胞）127】共转化:一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子。128】CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 ：1、将处于对数生长期的细菌置于0的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经42短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；129】4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。130】感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的

43、生理状态的细胞131】重组DNA导入真核细胞：（1）导入酵母细胞：原生质体转化（共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法）、碱金属离子介导的完整细胞转化、P132】农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法：将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA、将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌、通过农杆菌侵染植物外植体、将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株（2）导入植物细胞：载体介导的转化（农杆菌介导）、DNA直接导入（基因抢法、电击法等）、种质系统法（花粉管通道法等）（三）导入动物细胞：磷酸钙沉淀法、脂质体介导法、显微注射法、DEAE(二乙氨乙基)-葡聚糖葡聚糖转染法133】转化率（cfu / gDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。转化率 产生菌落的总数 / DNA的加入量 例1：取1l（0.1 ng/l）完整的质粒转化100l的感受态细胞。向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，取100l铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？转化率1000 / 0.01 ng DN