第九章 分子发光分析法

1、生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第九章第九章 分子发光分析法分子发光分析法生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法 基态分子吸收基态分子吸收能量能量( (电能、热能、化学能或光能电能、热能、化学能或光能等等) )，电子由基态，电子由基态跃迁跃迁到激发态，当电子由激发态到激发态，当电子由激发态返返回回基态时，以发射基态时，以发射电磁辐射电磁辐射( (即光即光) )的形式释放能量。的形式释放能量。 分子发光：分子发光：分子分子 +电

2、能电能化学能化学能光能光能生物活性参生物活性参与化学发光与化学发光 电致发光电致发光化学发光化学发光光致发光光致发光生物发光生物发光荧光荧光磷光磷光生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法分子发光：分子发光：M +能能量量M*M +hv光致发光：光致发光：M + hvM*M +hv生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法第一节第一节 分子荧光、磷光产生基本原理分子荧光、磷光产生基本原理 第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子

3、结构的关系第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程第六节第六节 定量分析方法定量分析方法生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理一、分子基态、激发态一、分子基态、激发态二、二、电子自旋多重度电子自旋多重度 三、激发态到基态的能量传递途径三、激发态到基态的能量传递途径生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理一、分子基态、激发态一、分子基态、激发态激发态：激发态： 基态分子吸收

4、能量后，价层电子跃迁到基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能高能级级的分子轨道上称为电子激发态的分子轨道上称为电子激发态 。是分子的。是分子的亚稳亚稳定状态定状态。基态：基态： 在正常状态下，分子处于在正常状态下，分子处于最低能级最低能级的分子轨的分子轨道上称为基态。是分子的道上称为基态。是分子的稳定状态稳定状态。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理二、二、电子自旋多重度电子自旋多重度 电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋状态可以处在不同的自旋状态, ,常用常用电

5、子自旋多重度电子自旋多重度来描述来描述。M = 2S + 1S是电子的总自旋量子数是电子的总自旋量子数S为各电子自旋量子数的代数和。为各电子自旋量子数的代数和。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理 单重态（单重态（M=1）：）：电子自旋都配对的分子的电电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，子态称为单重态，用用“S”表示。表示。 三重态（三重态（M=3）：）：分子中的电子对的电子自旋分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，平行的电子态称为三重态，用用“T”表示。表示。S2 T2 S1 T1 S0 ( (洪特规

6、则洪特规则) ) 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理三、激发态到基态的能量传递途径三、激发态到基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过通过辐射跃迁辐射跃迁( (发光发光) )和和非辐射跃迁非辐射跃迁( (热热) )等方式失去等方式失去能量能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫非辐射跃迁非辐射跃迁延迟荧光延迟荧光外转换外转换返回速度快的途径，发生几率大返回速度快的途径，发生几率大!生物与化学工程

7、学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析S2S0ehv1. 振动弛豫：振动弛豫：同一电子能级同一电子能级内以内以热能量交换热能量交换形式由形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间弛豫的时间10 -12 s。( (一一) )、非辐射跃迁非辐射跃迁第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析S2S0S1ehv2. 内转换内转换：相同多重度相同多重度的电子能级中的电子能级中, 相等能级相等能级间的间的非辐射能级交换。发生内转换的时间非辐射能级交换。发生内转换的时间10-

8、12 s。第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析S2S0S1T1ehv3. 系间跨越系间跨越：不同多重态不同多重态在有在有重叠的转动能级重叠的转动能级间的间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋- -轨道耦合等跃迁。轨道耦合等跃迁。第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析4. 外转换外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射间产生相互

9、作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析S2S0S1T11. 荧光发射：荧光发射：电子由电子由第一激发单重态的最低振动能第一激发单重态的最低振动能级级基态各振动能级基态各振动能级，发射时间约为发射时间约为10-710-9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长波长长。 ehvhv( (二二) )、辐射跃迁辐射跃迁第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生

10、物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析2. 磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能第一激发三重态的最低振动能级级基态基态各振动能级各振动能级。发光时间：发光时间：10-4100s 。S2S0S1T1hvehvS0 激发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 S0 第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征一、荧光激发光谱一、荧光激发光谱二、二、荧光发射光谱荧光发射光谱 三、荧光光谱的基本特征三、荧光光谱的基本

11、特征生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征一、荧光激发光谱一、荧光激发光谱 固定荧光波长，固定荧光波长，改变激发光波长改变激发光波长，测定不同波长的激测定不同波长的激发光激发所得到的发光激发所得到的荧光强度与激发光荧光强度与激发光波长曲线。波长曲线。 200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱。激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱。 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪

12、器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征二、二、荧光发射光谱荧光发射光谱 200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 固定激发波长，固定激发波长，扫描发射波长，扫描发射波长，测定测定化合物发射的荧光强化合物发射的荧光强度与不同发射波长曲度与不同发射波长曲线线。发射光谱的形状与激发波长无关。发射光谱的形状与激发波长无关。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征三、荧光光谱的基本特

13、征三、荧光光谱的基本特征（一）、一）、Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。产生原因：产生原因： 1. 振动弛豫及内转换，产生位移主要原因；振动弛豫及内转换，产生位移主要原因； 2. 基态不同振动能级间振动弛豫至最低振动能级；基态不同振动能级间振动弛豫至最低振动能级； 3. 外转换。外转换。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征（二）、（二）、发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 荧光分子吸收不同波长的能量荧光分子吸收不同波长的能量，电子跃迁电子跃迁到不同激发态

14、能级，产生不同吸收带，到不同激发态能级，产生不同吸收带，但都通但都通过过无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式回到回到第一激发单重态的最低第一激发单重态的最低振动能级振动能级再跃迁回到再跃迁回到基态各振动能级基态各振动能级，产生波，产生波长一定的荧光。长一定的荧光。 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征（三）、（三）、荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。光谱形状一样）成镜像对称关系。生物与化学工程学院生物

15、与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系一、分子产生荧光必须具备的条件一、分子产生荧光必须具备的条件二、二、化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系一、分子产生荧光必须具备的条件一、分子产生荧光必须具备的条件1. 具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子；性结构的有机分子；2. 具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）： 衡量荧光物质发

16、光能力。衡量荧光物质发光能力。 它表示激发分子发射出荧光它表示激发分子发射出荧光(或磷光或磷光) 的比例。的比例。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系f=发射的光量子数发射的光量子数吸收的光量子数吸收的光量子数f=发射发射荧光的分子数荧光的分子数被激发的分子数被激发的分子数生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光率常数有关，可

17、用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：量子产率：ffiiKKK 荧光发射过程的荧光发射过程的速率常数，取决速率常数，取决于分子结构。于分子结构。iICISCQiKKKK各种无辐射跃迁过程的速各种无辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也所处的化学环境，同时也与化学结构有关。与化学结构有关。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系二、二、化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光 （一）、（一）、 跃迁的类型跃迁的类型对于有机荧光物质对于有机荧光物质: : n * max100 平均寿命

18、平均寿命10-510-7 s；* max104 平均寿命平均寿命10-710-9 s S T速率速率kISC小。小。* 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。* * n生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系（二）、（二）、 共轭效应共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动。移动。化合物化合物量子产率量子产率F ex（nm） em（nm） 苯苯萘萘蒽蒽丁

19、省丁省0.110.290.460.60205286365390278321400480生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系（三）、（三）、 刚性平面结构刚性平面结构芴芴f = 1联苯联苯f = 0.21. 减少分子振动，减小外转换。减少分子振动，减小外转换。2. 增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系荧光黄荧光黄f = 0.92酚酞酚酞f = 0生物与化学工程学院生物与化

20、学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系（三）、（三）、 取代基效应取代基效应1. 给电子取代基加强荧光给电子取代基加强荧光-NH2，-NHR ，-NR2，-OH， -OR ，-CN产生产生 p 共轭共轭2. 吸电子取代基减弱荧光吸电子取代基减弱荧光-C=O， -COOH ，-NO2n * 跃迁，跃迁， 摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱，相应磷光增强。跃较大，同样使荧光减弱，相应磷光增强。 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度

21、的环境因素一、溶剂一、溶剂二、二、温度温度 三、溶液的三、溶液的PH值值四、四、内滤光作用与自吸现象内滤光作用与自吸现象 五、五、荧光猝灭荧光猝灭 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素一、溶剂一、溶剂 主要表现为主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键溶剂的极性、氢键、配位键的形成对的形成对化合物的荧光发生变化。化合物的荧光发生变化。 * * 跃迁类型：激发态极性比基态大，溶剂极跃迁类型：激发态极性比基态大，溶剂极性增大，性增大，跃迁能量降低跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。，发生红移，荧光增强。 氢键、配位键的形成主要影响荧

22、光分子的氢键、配位键的形成主要影响荧光分子的存在型存在型体、电离状态体、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。，荧光强度和形状均发生很大变化。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素二、二、温度温度 温度升高，外转换的几率增加。荧光强度降低。温度升高，外转换的几率增加。荧光强度降低。三、溶液的三、溶液的PH值值不同不同PH值下，荧光分子存在形式不同。值下，荧光分子存在形式不同。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素四、四、内滤光作用与自吸现象内滤光作用

23、与自吸现象 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。收；如蒽化合物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收荧光物质溶液中含有能吸收荧光物质发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾。发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素五、五、荧光猝灭荧光猝灭 荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间存在荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间存在相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。相

24、互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。（一）、（一）、 碰撞猝灭碰撞猝灭-动态猝灭动态猝灭 M* + Q M + Q + 热量热量激发态分子激发态分子猝灭剂猝灭剂生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素（二）、（二）、 生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭-静态猝灭静态猝灭 M + Q M Q 基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。化合物，导致荧光的猝灭。（三）、（三）、 氧的猝灭氧的猝灭 氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，可

25、能包含着多种机理。杂，可能包含着多种机理。 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素（四）、（四）、 自猝灭自猝灭 荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低。荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等。 自猝灭可能有如下几个原因：自猝灭可能有如下几个原因：1. 荧光物质分子之间的碰撞能量损失荧光物质分子之间的碰撞能量损失; ;2. 荧光物质的自吸收荧光物质的自吸收; ;3. 荧光物质分子的缔合。荧光物质分子的缔合。生物与化学工程学院生物与化学工程学

26、院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光、磷光化学荧光、磷光化学/生物发光生物发光美国瓦里安技术中国有限公司美国瓦里安技术中国有限公司生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程一、一、荧光分光光度计结构流程荧光分光光度计结构流程 二、二、磷光分光光度计结构流程磷光分光光度计结构流程 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程一、一、荧光分光光度计结构流程荧光分光光度计

27、结构流程 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器组成：组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器。激发光源、样品池、双单色器、检测器。特殊点：特殊点：两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程（一）、（一）、激发光源激发光源 氙灯氙灯、高压汞灯，染料激光器。、高压汞灯，染料激光器。（二）

28、、（二）、单色器单色器 激发单色器：激发单色器：选择激发光波长，选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。用以分离出所需用的激发光。发射单色器：发射单色器：选择荧光发射波长，选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。拉曼光和杂质所发射的荧光。 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程（三）、（三）、样品池样品池 I0ItIf样品池四面透光。样品池四面透光。（四）、（四）、检测器检测器 光电倍增管。光电倍增管。 检测器的方向与激发光的方向成直角，以消检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中除样品池中