HPLC测定冬白梅片中黄芩苷的含量(最终版)

1、毕 业 论 文论文题目 HPLC测定冬白梅片 中黄芩苷的含量 学 院 化学化工学院 专 业 制药工程 年 级 2010级 学 号 201024105207 学生姓名 李明新 指导教师 覃 亮 完成时间 2014 年 3 月肇庆学院教务处制HPLC测定冬白梅片中黄芩苷的含量 李明新 指导教师：覃 亮摘 要 目的：通过实验，建立一种稳定可靠的HPLC法测定冬白梅片中黄芩苷的含量。检测方法：HPLC法，以Diamonsil C18 5m 2504.6mm 为色谱柱，以甲醇-0.2%磷酸（50:50）为流动相，流速1.000mL/min，柱温35，以277nm为检测波长，采用峰面积外标法进行定量分析。

2、检测结果：在此条件下，黄芩苷的含量在0.2515g1.5089g范围内与峰面积呈良好的线性关系（R2= 0.9999，n=6），平均加样回收率为97.95%，RSD%=0.45%（n=6）。结论：本法操作简便，专属性强，分离效果好，结果准确。关键词 冬白梅片；黄芩苷；含量测定；HPLC1引言1.1 概述黄芩（ScuteLLaria baicaLensis Georgi）是一种芩草，有山茶根、土金茶根的别称。黄芩为唇形科植物，“芩”字本义为“止血草”，因其草颜色显黄色而俗称“黄芩”。黄芩以根入药，味苦、性寒，具有清热燥湿1，凉血安胎，清热解毒2等功效。黄芩主要生长于河北、陕西、黑龙江、辽宁、内蒙

3、古、山东等地。黄芩的抗菌性临床应用效果比黄连还要好，重要的是黄芩不产生抗药性3。同时，黄芩的提取液在农业病害防治方面发挥着重大作用，黄芩还是一种常用的中药。黄芩苷（BaicaLin）是一种黄酮类化合物，主要从黄芩的根提取分离获得。黄芩苷的生物活性显著4，有利尿、抑菌、抗变态、抗炎及解痉的作用5，并且具有很强的抗肿瘤反应和其他生理效能6。黄芩苷因具有吸收紫外线7，清除氧自由基8-9等功效，可用于医药，又因能阻止生成黑色素而成为一种很好的功能性美容化妆品原料。1.2 实验目的与意义冬白梅片收载于卫生部药品标准中药成方制剂第四册，由天冬83g、麻黄（密制）42g、乌梅83g、防风62g、五味子83g

4、、黄芩83g、白果仁83g、平贝母83g等八味中药加工制成，主要用于止咳化痰10，敛肺定喘。由于该药品标准中没有测定其有效成分的含量的方法，故本文通过采用HPLC法测定该药中黄芩苷的含量来控制该制剂的质量，实验结果表明该方法简单、准确、重现性好，为该制剂的质量控制提供了定量检测方法。2仪器与材料Dionex U-3000高效液相色谱仪(YQ-A89) chromeleon7.1色谱工作站；UV-2450紫外分光光度计（YQA09）；AUW-220D电子天平（YQ-A93）；KQ5200DA型数控超声波清洗器（功率200W，频率40kHz）；黄芩苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号1107

5、15-201117，供含量测定用，含量以91.7%计)；冬白梅片(批号130216，130507，121209)；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯；3实验方法和方法学考察3.1实验方法3.1.1检测波长的选择11本文参照中国药典中双黄连片供试品溶液的制备方法制备冬白梅片（批号：121209）供试品溶液：取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量，置100mL量瓶中，加50甲醇适量，超声处理（功率200W，频率40kHz）20分钟，放冷，加50甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得12。取黄芩苷对照品溶液在250350nm波长范围内进行波长扫描，图谱中黄芩苷在277nm

6、波长处有最大吸收（见图1）。为了保证检测的灵敏性，所以选择277nm 为检测波长。 图1 检测波长的选择3.1.2 流动相的确定参照中国药典中牛黄上清片的测定方法以甲醇-0.2%磷酸溶液（43:57）为流动相13。结果显示黄芩苷的塔板数和分离度均符合要求，出峰时间为16.262min。调节流动相比例为甲醇-0.2%磷酸溶液（50:50），黄芩苷的塔板数和分离度仍符合要求，出峰时间提前到12.679min（见图2）。为了节省检测时间，所以选择甲醇-0.2%磷酸溶液（50:50）为流动相。图2 流动相的选择3.1.3 供试品溶液的制备14取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量，置10

7、0mL量瓶中，加50%甲醇溶液适量，超声处理20min，取出，放冷，加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。为了验证该方法能否将样品中的黄芩苷提取完全，取本品共五份，每份约0.4161g，分别置于100mL量瓶中，加50甲醇适量，分别超声处理（功率200W，频率40kHz）10、20、30、40、50分钟，放冷，加50甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取上述5份供试品溶液按峰面积外标法分别测定超声10、20、30、40、50min的供试品溶液中黄芩苷的含量，结果显示超声20min后的供试品溶液中黄芩苷的含量非常接近（见表1），表明超声20min可以提取完全。另取本品粉

8、末两份，每份约0.4161g，分别置100mL量瓶中并编号供试品1、2，供试品1加甲醇适量，供试品2加50%甲醇适量，超声处理（功率200W，频率40kHz）20分钟，放冷，供试品1加甲醇稀释至刻度处，供试品2加50甲醇稀释至刻度处，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按峰面积外标法测定供试品1、2中的黄芩苷含量，结果显示供试品1和2的含量非常接近（见图3）。为了节约试剂，所以选择50%甲醇作为制备液。表1 超声处理结果超声时间（min）1020304050含量（mg/片）2.05422.22212.20812.21712.2197 图3 制备溶液的选择3.1.4 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照

9、品适量，置100mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释到刻度处，摇匀，精密量取上述溶液10mL置20mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释到刻度处，滤过，取续滤液，即得。3.1.5 阴性溶液的制备 按冬白梅片的制备工艺及制备过程中的处方比例，配制不含黄芩的阴性对照样品，按“3.1.3”项下方法制成阴性对照溶液。3.1.6 色谱条件以甲醇-0.2%磷酸（50:50）为流动相，流速1.000mL/min，柱温35，检测波长为277nm，进样量为对照品溶液和供试品溶液各20L，在此条件下，按黄芩苷计算，理论塔板数应不少于2500，且阴性无干扰15。3.2 方法学考察163.2.1专属性实验在“3.1.6”项色谱

10、条件下，分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20L，注入液相色谱仪，记录色谱图。验证不含黄芩的阴性对照品溶液无干扰。3.2.2线性关系考察精密称定黄芩苷对照品10.97mg，按“3.1.4”项下方法制成浓度为50.2974g/mL的对照溶液，取上述溶液分别进样5L、10L、15L、20L、25L、30L，测定色谱峰面积，记录色谱图。3.2.3精密度试验取同一浓度的黄芩苷对照品溶液（50.2974g/mL），按拟定的色谱条件连续进样6次，测定黄芩苷的峰面积并记录色谱图。3.2.4稳定性试验稳定性是指在一定的测定条件下，时间对样品溶液测定结果的影响程度。取同一份供试品溶液（批号：1212

11、09），分别在0、5、10、15、20、25h 依次进样，测得其峰面积并记录色谱图。3.2.5重复性试验精密量取同一批样品（批号：121209）6 份，按“3.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“3.1.6”项下拟定的色谱条件进样分析，测定峰面积并记录色谱图。3.2.6样品测定取供试品3批，按供试品溶液的制备方法制备。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20L，注入高效液相色谱仪，按上述含量测定方法进行测定，记录色谱图，用峰面积外标法计算黄芩苷的含量。3.2.7加样回收率试验取同一批已知含量（批号：121209，含量 2.2772mg/片）的供试品6份，每份取样量为供试品取样量（0.4161g

12、）的50%，以当前取样含量的1:1，分别精密加入黄芩苷对照品溶液（0.1102mg /mL）10mL，按含量测定方法测定，记录色谱图，用峰面积外标法计算黄芩苷的含量。4实验结果与分析4.1专属性实验结果测定结果显示：阴性对照溶液在与黄芩苷对照品相同保留时间位置上未出现色谱峰，因此认为阴性对照无干扰（见图4）。CABA 黄芩苷对照品(tR=12.650，n=4916)B 供试品（tR=12.746，n=6920）C 阴性对照（tR=12.650，未检测到峰）图4 专属性实验结果4.2 线性关系考察结果按“3.1.6”项下拟订的色谱条件测定，记录峰面积值，按含量测定的方法测定，数据见表2。表2 线

13、性考察结果进样量（L）0.25150.50300.75451.00591.25741.5089峰面积164529932680554905962655256082749219855769以测得的峰面积为纵坐标（Y），对照品的进样量为横坐标（X），得到回归方程：y=6557845.9787x21788.3638R2=0.9999标准曲线图如图5所示：图5 线性考察结果该关系考察曲线的相关系数R2=0.9999，表明黄芩苷在0.2515g1.5089g 范围内呈良好的线性关系。4.3精密度试验结果中国药典规定含量测定方法学验证中精密度试验的相对标准偏差RSD%不得大于3%，本次试验计算测得黄芩苷的峰

14、面积的RSD%为0.35%，表明本实验的仪器精密度良好（色谱图见图6，数据见表3）。 图6 精密度试验结果 表3 精密度试验结果实验编号峰面积 RFRF平均值RSD%1234566475188644598764289806425984643104064101931.287310111.281510111.278110111.277610111.278610111.27441011 1.279610110.354.4稳定性试验结果在拟定的同一色谱条件下对同一供试品溶液在0、5、10、15、20、25h分别进样，结果显示黄芩苷含量的RSD%为0.23%，表明供试品溶液在25 h 内稳定性良好（色谱

15、图见图7，数据见表4）。图7 稳定性试验结果表4 稳定性试验结果时间（h）0510152025峰面积平均值RSD%29464862947110294467829405000.232937495293629329309384.5重复性试验结果取6份同一个批号（批号：121209）的供试品，在同一谱条件下进行测定，用峰面积外标法计算黄芩苷的含量，结果测得黄芩苷平均含量为2.2753mg/片，RSD%为0.20%（n=6），表明本方法重复性良好（色谱图见图6，数据见表5）。图8 重复性试验结果表5 重复性试验结果实验编号取样量（g）峰面积含量（mg/片）平均值（mg/片）RSD% 1 2 3 4 5

16、 60.41630.41640.41670.41620.41660.41632911052292400829250722921898292314729117332.26942.27892.27812.27842.27722.2699 2.27530.204.6样品测定结果按拟定的同一色谱条件下将3批样品分别进行2次含量测定，结果测得批号为130216的冬白梅片中黄芩苷含量的平均值为2.3205mg/片，批号为130507的的冬白梅片中黄芩苷含量的平均值为2.2445mg/片，批号为121209的冬白梅片中黄芩苷含量的平均值为2.2772mg/片（色谱图见图9，数据见表6）。图9 样品测定结果表

17、6 样品测定结果 批号 取样量（g）含量（mg/片）平均值（mg/片） 130216 130216 130507 130507 121209 1212090.42150.42160.41630.41620.41790.41782.32392.31712.24602.24292.27452.27992.3205 2.24452.27724.7加样回收率试验结果为了验证所建立的方法对供试品含量测定是否有影响，对同一批相同浓度供试品进行回收率试验。结果显示黄芩苷的平均回收率为97.95%，RSD%=0.45%，表明所建立的方法对样品含量处理的损失程度较低（色谱图见图10，数据见表7）。图10 加样回

18、收率结果表7 加样回收率结果实验序号供供试品取量（g）供供试品含量（mg）对对照品加入量（mg）测测定结果（mg/片）回回收率（%）平平均值（%）RRSD （%）1234560.20860.20930.20920.20950.20870.20891.14161.14541.14491.14651.14221.14331.1021.1021.1021.1021.1021.1022.22372.21602.22912.22492.22382.222598.2097.1598.3897.8598.1697.9497.950.455结论经过实验，我们确立了冬白梅片中黄芩苷的含量测定的方法，本方法操作简

19、便。且此方法分离度高，并且重复性良好，干扰小，效果显著可靠，可以为冬白梅片生产及流通过程中的质量控制提供参考。参考文献：1 刘晶晶, 张贵君, 彭慧, 董文茜, 高晓美. 黄芩清热燥湿和泻火解毒药效组分分析J. 辽宁中医药大学学报, 2013, 15(11): 78-80.2 王芝凯. 黄芩的要用及配伍M. 新世纪全国中药研究暨中药房管理学术研讨会论文汇编, 55-56.3 张立新, 方芳. 黄芩苷栽培技术J. 中草药, 2012,5: 58.4 宁宏. 黄芩黄酮类化学成分药理研究新进展J. 内蒙古中医药, 2013,15: 142-143.5 杜亚伟. 黄芩苷对发热大鼠体温及血清白细胞介素-

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