免疫印迹201300111

1、smu_免免 疫疫 印印 迹迹免免 疫疫 印印 迹迹基本原理基本原理应用应用 基本流程基本流程1.制制 胶胶具体步骤：具体步骤： 待分离蛋白质的分子量（待分离蛋白质的分子量（KDKD）四甲基乙二胺四甲基乙二胺 ( (引发剂引发剂增速剂增速剂p制胶制胶p不连续电泳不连续电泳:使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳 浓缩胶浓缩胶(积层胶积层胶)的作用的作用:使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带浓缩成一窄带;便于分离以及得到漂亮的蛋白条带便于分离以及得到漂亮的蛋白条带. 分离胶的作用分离胶的作用:分离分子量不同的蛋白质亚基分离分子量不

2、同的蛋白质亚基(分子筛效应分子筛效应)+带负电荷的带负电荷的SDS-蛋白复合体蛋白复合体+分子栅栏效应分子栅栏效应没有滑动加样或未加水没有滑动加样或未加水2.加样前枪头外壁干净加样前枪头外壁干净,加完样后枪头慢慢从孔中拿出加完样后枪头慢慢从孔中拿出,以免样本带出以免样本带出,污染电泳液污染电泳液p样品的制备样品的制备匀浆法匀浆法机械法机械法研磨法研磨法超声法超声法冻融法冻融法p样品的制备样品的制备样品溶于上样缓冲液后样品溶于上样缓冲液后,100,100水浴煮沸水浴煮沸3-53-5分钟分钟. .1.样品加热时间过长样品加热时间过长,导致蛋白样品出现聚集导致蛋白样品出现聚集.100,5min2.样

3、品中含有高离子浓度样品中含有高离子浓度,导致电泳后蛋白条带变形导致电泳后蛋白条带变形.3.为避免蛋白丢失为避免蛋白丢失,上样量不要超过泳道体积上样量不要超过泳道体积.4.上样量过多或电泳前停留过长时间上样量过多或电泳前停留过长时间,会导致样品污染临会导致样品污染临近泳道近泳道.5.样品处理后样品处理后,不要放于室温时间过长不要放于室温时间过长,以免降解以免降解.样品可能出现的问题样品可能出现的问题:3.指示剂皱眉指示剂皱眉SDS-PAGE失败实例及分析失败实例及分析 指示剂微笑指示剂微笑拖尾拖尾(tailling)上样过多上样过多电流过大电流过大多次加胶多次加胶电泳过早停止电泳过早停止1.缓冲

4、液会与所分离的样品接触，加入甘氨酸缓冲液会与所分离的样品接触，加入甘氨酸为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。环境。 2.电解时缓冲液温度较高，而电解时缓冲液温度较高，而Tris受温度影响受温度影响pH变化较大，甘氨酸可以起到缓冲作用。变化较大，甘氨酸可以起到缓冲作用。 3.甘氨酸与样品的浓缩效应有关。甘氨酸与样品的浓缩效应有关。具体步骤：具体步骤：NC膜膜滤纸滤纸支持垫支持垫NC凝胶凝胶阳性电极阳性电极转印缓冲液转印缓冲液尺寸：支持垫滤纸尺寸：支持垫滤纸NC凝胶凝胶具体步骤：具体步骤：滤纸滤纸支持垫支持垫NC凝胶凝胶阳性电极阳性电极转印缓冲液转印缓

5、冲液尺寸：支持垫滤纸尺寸：支持垫滤纸NC膜凝胶膜凝胶具体步骤：具体步骤：电转膜电转膜Ag显色反应显色反应非非特特异异结结合合信信号号电转膜电转膜Ag封闭液封闭液显显色色反反应应特异性结合信号特异性结合信号常用的封闭液常用的封闭液封闭缓冲液封闭缓冲液 组成组成 优点优点 缺点缺点5%脱脂奶粉脱脂奶粉 5%w/v脱脂奶粉脱脂奶粉 价廉价廉 易变质易变质 溶于溶于PBS中中 背景清晰背景清晰 可掩饰某些抗原可掩饰某些抗原 不适于亲和素体系不适于亲和素体系5%脱脂奶粉脱脂奶粉/吐温吐温 5%w/v脱脂奶粉脱脂奶粉/0.2% 价廉价廉 易变质易变质 Tween20/PBS 背景清晰背景清晰 可掩饰某些抗

6、原可掩饰某些抗原Tween 0.2%Tween溶于溶于PBS 可在抗原检测可在抗原检测 可能有一些残留可能有一些残留 后染色后染色 的本底的本底BSA 3%BSA/PBS 信号强信号强 相对较贵相对较贵 一抗一抗二抗二抗1：100001：100001：100001：50001：200001：100000信号弱或无信号信号弱或无信号-actin43 kDa胞浆和全细胞胞浆和全细胞GAPDH30-40 kDa胞浆和全细胞胞浆和全细胞55 kDa胞浆和全细胞胞浆和全细胞VCDA1/Porin31 kDa 线粒体线粒体COXIV16 kDa线粒体线粒体TBP38 kDa细胞核细胞核RMB：4000-7000 /100ug凋亡和信号传导产品专业生产商凋亡和信号传导产品专业生产商信号转导产品公司信号转导产品公司, 提供细提供细胞信号转导方面的抗体胞信号转导方面的抗体RMB：1000-3000 /100ug中档抗体的最佳品牌中档抗体的最佳品牌,曾为曾为Ab