第3章植物组织培养与细胞

1、第第3 3章章 植物组织培养与细胞培养植物组织培养与细胞培养东北大学生物技术研究所东北大学生物技术研究所3.3 3.3 植物组织与器官培养植物组织与器官培养3.3.1 3.3.1 植物组织培养的定义与分类植物组织培养的定义与分类3.3.2 3.3.2 重要概念重要概念3.3.3 3.3.3 细胞分化和形态建成细胞分化和形态建成3.3.4 3.3.4 植物组织培养的基本步骤植物组织培养的基本步骤3.3.5 3.3.5 植物组织器官培养植物组织器官培养3.3.6 3.3.6 植物组织培养的应用植物组织培养的应用3.3.7 3.3.7 人工种子人工种子3.3.8 3.3.8 植物组织与器官的生物反应

2、器培养植物组织与器官的生物反应器培养3.3.9 3.3.9 植物组织与器官培养存在的问题植物组织与器官培养存在的问题3.3.1 3.3.1 植物组织培养的定义与分类植物组织培养的定义与分类1.1.定义定义 植物组织培养植物组织培养(plant tissue culture)(plant tissue culture)是指在无是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原胚乳、皮层等）、胚胎（如成熟和未成熟

3、的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。完整植株的一种实验技术。其理论基础是细胞的全能其理论基础是细胞的全能性。性。 2.2.分类分类根据根据外植体种类外植体种类的不同的不同，组织培养可分为：，组织培养可分为：器官培养、器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。根据根据培养方法培养方法的不同，组织培养可分为：的不同，组织培养可分为：微室培养、平微室培养、平板

4、培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等板培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等。根据根据培养的功能性培养的功能性的不同，组织培养可分为：的不同，组织培养可分为：再生体系、再生体系、离体受精、突变体选择、体细胞杂交等。离体受精、突变体选择、体细胞杂交等。3.3.2 3.3.2 重要概念重要概念 全能细胞（全能细胞（totipotent cell)totipotent cell) 愈伤组织愈伤组织 (callus)(callus) 外植体外植体 (explantation)(explantation) 继代培养继代培养 (secondary culture)(secondary culture) 胚胎

5、培养胚胎培养 (embryo culture)(embryo culture) 脱分化（脱分化（dedifferentiation dedifferentiation ） 再分化（再分化（redifferentiation)redifferentiation) 茎尖培养茎尖培养 无性繁殖系无性繁殖系 (clone)(clone) 器官发生（器官发生（organogenesis)organogenesis) 胚状体（胚状体（embryoid)embryoid) 全能细胞（全能细胞（totipotent cell)totipotent cell)：能够表达生物体基因组的任能够表达生物体基因组的任何

6、一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同生物体。为一个完全相同生物体。 愈伤组织愈伤组织(callus)(callus)：在离体培养过程中由外植体组织增生的细在离体培养过程中由外植体组织增生的细胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞。胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞。 外植体外植体(explant)(explant)：从植物体上分离下来的用于离体培养的材从植物体上分离下来的用于离体培养的材料，可以是器官、组织和原生质体等。料，可以是器官、组织和原生质体等。 继代培养继代

7、培养(secondary culture)(secondary culture)：更换新鲜培养基来繁殖同更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织种类型的材料（愈伤组织. .芽等）。芽等）。 胚胎培养胚胎培养(embryo culture):(embryo culture):包括原胚和成熟胚培养、胚乳包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房培养、胚珠和子房( (未授粉或已授粉的未授粉或已授粉的) )培养，可用于研究胚胎发生以培养，可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素；用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘及影响胚生长的因素；用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂种，因此它也是研究生

8、殖生理的有用方法；胚乳培养是研究胚乳的杂种，因此它也是研究生殖生理的有用方法；胚乳培养是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系，以及获得三倍体植株的一个手段。功能、胚乳与胚的关系，以及获得三倍体植株的一个手段。 脱分化（脱分化（dedifferentiation dedifferentiation ）: :已分化好的细胞在人工诱已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。 再分化（再分化（redifferentiation):redifferentiation):脱分化后具有分生能力的细脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来

9、相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。 茎尖培养茎尖培养: :较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养。较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养。通常用通常用110mm110mm大小的外植体来加速植物的无性系繁殖。大小的外植体来加速植物的无性系繁殖。 无性繁殖系无性繁殖系(clone)(clone)：由同一个外植体反复进行继代培养后所由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代。得一系列的无性繁殖后代。 器官发生（器官发生（organogenesis)organogenesis)：在组织培养中或悬浮培养

10、中，在组织培养中或悬浮培养中，由培养物到显示有自然的器官形成，如形成芽或根的现象。由培养物到显示有自然的器官形成，如形成芽或根的现象。 胚状体（胚状体（embryoid)embryoid)：在离体培养过程中产生一种形似胚（具在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。3.3.3 3.3.3 植物细胞分化和形态建成植物细胞分化和形态建成 一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个步骤：步骤： (1) (1) 培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织；培养的植物细胞或组

11、织的脱分化，形成愈伤组织； (2) (2) 有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后又有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后又由其分化成不同的器官原基（如根原基、叶原基等）。由其分化成不同的器官原基（如根原基、叶原基等）。 脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式：脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式： （1 1）器官发生方式：其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成，）器官发生方式：其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成，具有单极性结构。具有单极性结构。 （2 2）胚胎发生方式：在愈伤组织表面或内部形成很多）胚胎发生方式：在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体胚状体，

12、它们类，它们类似于合子胚，具有双极性结构。似于合子胚，具有双极性结构。魔芋胚状体魔芋胚状体通过胚状体途径产生再生植株有通过胚状体途径产生再生植株有3 3个显著优点：个显著优点： （1 1）在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定）在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽数目多；芽数目多； （2 2）胚状体形成的速度快；）胚状体形成的速度快； （3 3）胚状体结构完整，一旦形成，一般都可以直接萌发）胚状体结构完整，一旦形成，一般都可以直接萌发形成小植株，因此成苗率高。形成小植株，因此成苗率高。3.3.4 3.3.4 植物组织培养的基本步骤植物组织培养的基本步骤以胡萝卜为例，介绍植物组织

13、培养的一般过程以胡萝卜为例，介绍植物组织培养的一般过程（图解图解）：）：（1 1）培养材料的采集培养材料的采集（2 2）培养材料的消毒培养材料的消毒（3 3）制备外植体制备外植体（4) 4) 接种和培养接种和培养（5 5）组培苗的练苗和移栽组培苗的练苗和移栽花药培养花药培养单倍体细胞和胚单倍体细胞和胚状体状体细胞和集合体细胞和集合体悬浮培养悬浮培养球形球形形成胚状体形成胚状体心形期心形期鱼雷期鱼雷期子叶期子叶期外植体外植体外植体在培养中直接振荡外植体在培养中直接振荡在培养液中振荡在培养液中振荡在生长素在生长素-营养物营养物琼脂培养基上生琼脂培养基上生长的愈伤组织长的愈伤组织植物组织培养的一般过

14、程的完整周期图解植物组织培养的一般过程的完整周期图解（1 1）培养材料的采集）培养材料的采集n组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中中根尖根尖不易灭菌，一般很少采用。不易灭菌，一般很少采用。n对于对于木本花卉木本花卉来说，阔叶树可在来说，阔叶树可在一、二年生一、二年生的枝条上的枝条上采集，采集，针叶树种针叶树种多采种子内的多采种子内的子叶或胚轴。草本植物子叶或胚轴。草本植物多采集多采集茎尖茎尖。n在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在快速

15、繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在在0.50.5厘米厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.10.1毫毫米以下米以下。（2 2）培养材料的消毒）培养材料的消毒n先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。毒刀片切成小块。n在无菌坏境中将材料放入在无菌坏境中将材料放入7070酒精中浸泡酒精中浸泡30306060秒。秒

16、。n再将材料移入漂白粉的再将材料移入漂白粉的饱和液饱和液或或0.010.01升汞水中消毒升汞水中消毒1010分钟。分钟。n取出后用无菌水冲洗三、四次。取出后用无菌水冲洗三、四次。（3 3）制备外植体）制备外植体n将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成片则不需剥皮。然后切成0.20.20.50.5厘米厚的小片，这厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。 （4) 4) 接种和培养接

17、种和培养n接种：接种： 在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种每瓶接种4 41010个。个。n封口：封口： 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。胶带封口。n温度：温度： 培养基大多应保持在培养基大多应保持在2525左右，但要因花卉种类及材左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。料部位的不同而区别对待。n增殖：增殖： 外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖

18、了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖增殖率的提高。增殖1 1个月左右后，可视情况进行再增殖。个月左右后，可视情况进行再增殖。n根的诱导：根的诱导： 继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。须转到生根培养基上进行生根培养。1 1个月后即可获得健壮根个月后即可获得健壮根系。系。（5 5）组培苗的练苗和移栽）组培苗的练苗和移栽n试管苗从无菌以及光照、温度、湿度稳定的环境进入自试管苗从

19、无菌以及光照、温度、湿度稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。然环境，必须进行炼苗。n一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3 3天天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的干净，再栽入已准备好的基质基质中，基质使用前最好消毒。中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿较高的空气湿度度（相对湿度（相对湿度9898左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。这是这是哪个哪个阶段？阶

20、段？这是这是哪个哪个阶段？阶段？植物组织培养流程图植物组织培养流程图3.3.5 3.3.5 植物组织器官培养植物组织器官培养n1.1.定义定义 植物组织器官培养植物组织器官培养就是在植物细胞全能就是在植物细胞全能性理论指导下，在组织以及器官水平上开展性理论指导下，在组织以及器官水平上开展研究的，其目的是实现植物细胞的全能性以研究的，其目的是实现植物细胞的全能性以完成植物生命周期的过程。完成植物生命周期的过程。2. 2. 愈伤组织诱导愈伤组织诱导（1) 1) 愈伤组织形成特点愈伤组织形成特点 由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过3 3个步骤：个步骤：v

21、 启动期（或诱导期）启动期（或诱导期）v 分裂期分裂期v 分化期分化期 启动期（或诱导期）启动期（或诱导期）: :是成熟组织在各种刺激因是成熟组织在各种刺激因素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程。受激作用后分裂前细胞的主要变化速加强的过程。受激作用后分裂前细胞的主要变化有：有：一是呼吸作用加强，消耗氧量明显增加；二是一是呼吸作用加强，消耗氧量明显增加；二是多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前RNARNA的含量可的含量可增加增加300%300%；三是蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋；三是蛋白质合成加快，

22、分裂前细胞内蛋白质的总量增加白质的总量增加200%200%；四是各种与分裂有关的酶活；四是各种与分裂有关的酶活性大大加强。性大大加强。分裂期：分裂期：其主要特征是：细胞数目增加很大，结构疏松，其主要特征是：细胞数目增加很大，结构疏松，缺少有组织特征的结构，一般呈现透明状或浅颜色。缺少有组织特征的结构，一般呈现透明状或浅颜色。分化期：分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化，出停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化，出现了形态和生理功能上的分化，直至出现了分生组织的现了形态和生理功能上的分化，直至出现了分生组织的瘤状结构及维管组织。此时，细胞体积不再减小，呈现瘤状结构及维管组织。此时，细胞体积

23、不再减小，呈现的颜色多种多样。的颜色多种多样。（2 2）愈伤组织的生长及分化）愈伤组织的生长及分化（3 3）影响愈伤组织培养的主要因素）影响愈伤组织培养的主要因素v 外植体外植体: :虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的潜在能力，但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的潜在能力，但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的难易程度差别很大。难易程度差别很大。v 基本培养基：基本培养基：众多的培养基基本上都可以诱导出众多的培养基基本上都可以诱导出愈伤组织，但不同的植物种类、基因型和外植体诱导愈伤组织，但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形成愈伤组织的难易程度不同，对培养基

24、的反应也有形成愈伤组织的难易程度不同，对培养基的反应也有差别。差别。v 激素组合：激素组合：通常高浓度的生长素和低浓度的激动通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和增殖。其中，素有利于愈伤组织的诱导和增殖。其中，2,4-D2,4-D是诱是诱导愈伤组织最有效的物质。导愈伤组织最有效的物质。3.3.举例举例以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术：以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术： 番杏别名洋菠菜，属番杏科番杏属的多年生草本植物。主要以肥番杏别名洋菠菜，属番杏科番杏属的多年生草本植物。主要以肥厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用，并可全株入药，有凉血、解毒、利尿、厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食

25、用，并可全株入药，有凉血、解毒、利尿、消疮疥等的功效。消疮疥等的功效。具体方法如下：具体方法如下：（1 1）材料和培养基：材料和培养基：番杏果实和幼苗；番杏果实和幼苗；(1(1）芽分化培养基：芽分化培养基：MS+6-MS+6-BA1.0mg/LBA1.0mg/L（单位下同）（单位下同）+NAA0.1+3.0%+NAA0.1+3.0%蔗糖蔗糖; ;(2(2）诱导愈伤组织与分化诱导愈伤组织与分化培养基：培养基：MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.5+3.0%MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.5+3.0%蔗糖蔗糖; ;(3(3）生根培养基：生根培养基：3/4MS+NAA0.1+1.5%3/

26、4MS+NAA0.1+1.5%蔗糖蔗糖; ;(4(4）继代培养基：继代培养基：MSMS培养基。以上各培养基培养基。以上各培养基加加0.7%0.7%琼脂，琼脂，PH5.8PH5.8。（2 2）培养条件：培养条件：培养温度培养温度2525左右，日光灯照明，每天光照左右，日光灯照明，每天光照10h, 10h, 光光照强度照强度10001500lx10001500lx。（3 3）无菌苗的获取：无菌苗的获取：将番杏果实在浓硫酸中浸泡约将番杏果实在浓硫酸中浸泡约1h1h，流水，流水冲洗冲洗30min30min。再在超净工作台（。再在超净工作台（图示图示）内用）内用70%70%乙醇浸泡乙醇浸泡2-2-3mi

27、n3min，在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干，再用，在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干，再用0.1%0.1%升汞浸升汞浸泡泡10min, 10min, 无菌水冲洗无菌水冲洗3-43-4次次, , 用无菌手术刀轻轻刮去果实被用无菌手术刀轻轻刮去果实被腐蚀的部分，然后将其接种于培养基腐蚀的部分，然后将其接种于培养基（3 3）中，培养中，培养1 1周后种周后种子长出无菌苗（子长出无菌苗（图示图示）。）。（4 4）愈伤组织培养：愈伤组织培养：切取切取0.5cm0.5cm长的不带腋芽的茎段，置于长的不带腋芽的茎段，置于（2 2）号培养基上。号培养基上。3 3周后，茎段周围出现白色松脆的愈伤组周后，茎段周围出现

28、白色松脆的愈伤组织（织（图示图示）。愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态）。愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。超净工作台番杏无菌苗番杏愈伤组织（5 5）继代培养：继代培养：将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出，用无将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出，用无菌水洗净，以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并菌水洗净，以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并用无菌水反复冲洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止。用用无菌水反复冲洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止。用解剖刀将愈伤块切成数小块，在接种到装有愈伤组织

29、诱导培养解剖刀将愈伤块切成数小块，在接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。基的三角瓶中，再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继几天后，三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的代培养。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的1 1个番杏茎段组个番杏茎段组织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养。织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养。（6 6）分化培养：分化培养：剥离白色松脆的愈伤组织继续置于剥离白色松脆的愈伤组织继续置于（2 2）号培号培养基上，养基上，

30、2 2月后，部分白色愈伤组织上出现绿色芽点（月后，部分白色愈伤组织上出现绿色芽点（图示图示）。）。随着时间推移，绿色芽点不断膨大，其中部分形成正常绿苗随着时间推移，绿色芽点不断膨大，其中部分形成正常绿苗（图示图示）。）。带绿色芽点的愈伤组织番杏分化绿苗番杏盆栽苗番杏无菌苗（7 7）生根培养：生根培养：剥离绿苗接种到剥离绿苗接种到（3 3）号培养基上诱导生根号培养基上诱导生根（图示图示）。）。7d7d后开始陆续出根，后开始陆续出根，3 3周后可有多条须根形成，周后可有多条须根形成，生根率达生根率达95.7%95.7%。（8 8）炼苗与移栽：炼苗与移栽：移栽前，敞瓶炼苗移栽前，敞瓶炼苗3-4d3-

31、4d，取出洗净后，取出洗净后，栽至装有蛭石的塑料杯中，加自来水，杯上罩上玻璃烧杯保栽至装有蛭石的塑料杯中，加自来水，杯上罩上玻璃烧杯保湿，湿，4d4d后昼覆夜敞，后昼覆夜敞，2 2周后可除掉玻璃杯。周后可除掉玻璃杯。3 3周后，试管苗张周后，试管苗张出新根，再将其移入蛭石与土（出新根，再将其移入蛭石与土（2 2：1 1）的盆（）的盆（图示图示）中。成）中。成活率为活率为83.3%83.3%。3.3.6 3.3.6 植物组织培养的应用植物组织培养的应用1. 1. 无性系快速繁殖技术无性系快速繁殖技术2. 2. 获得无病毒植株获得无病毒植株3. 3. 新品种培育新品种培育4. 4. 在遗传、生理生

32、化和病理等研究上的应用在遗传、生理生化和病理等研究上的应用5. 5. 种质资源的保存种质资源的保存6. 6. 产业化生产前景产业化生产前景 1. 1. 无性系快速繁殖技术无性系快速繁殖技术n对那些繁殖系数低或很难用种子繁殖的名特珍品种的繁殖实用意义更对那些繁殖系数低或很难用种子繁殖的名特珍品种的繁殖实用意义更大大, ,甚至是无可取代。甚至是无可取代。如脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良如脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖, ,以比常规育以比常规育苗方法快数百倍到数万倍的速度扩大繁殖苗方法快数

33、百倍到数万倍的速度扩大繁殖, ,及时提供大量优质种苗。及时提供大量优质种苗。如野生珍稀兰花属国家二级以上保护植物如野生珍稀兰花属国家二级以上保护植物, ,野生兰花的组织培养利于野生兰花的组织培养利于保护这些珍稀的植物资源。保护这些珍稀的植物资源。n目前目前, ,在国内外已掀起在国内外已掀起“试管苗试管苗”热热, ,如如国外在兰花、杜鹃、月季、草国外在兰花、杜鹃、月季、草莓、苹果、柑桔、石竹、铁线莲、桉树等莓、苹果、柑桔、石竹、铁线莲、桉树等进行快速繁殖已达到商品化进行快速繁殖已达到商品化生产生产; ;我国近年来已获成功推广的我国近年来已获成功推广的有甘蔗、葡萄、罗汉果、兰花、银有甘蔗、葡萄、罗

34、汉果、兰花、银杏、水稻、甘蔗、菠萝、香蕉、草莓、月季、菊花、无籽西瓜、栎树、杏、水稻、甘蔗、菠萝、香蕉、草莓、月季、菊花、无籽西瓜、栎树、山楂、猕猴桃、雪松等品种山楂、猕猴桃、雪松等品种。试管苗在国际国内市场上已形成产业化。试管苗在国际国内市场上已形成产业化生产生产, ,如广西都安县山葡萄苗、罗城县毛葡萄苗均由国内组织培养公如广西都安县山葡萄苗、罗城县毛葡萄苗均由国内组织培养公司提供司提供, ,每年需要量达数十万株。每年需要量达数十万株。2. 2. 获得无病毒植株获得无病毒植株n很多农作物都带有病毒很多农作物都带有病毒, ,病毒是植物的严重病害病毒是植物的严重病害, ,至至2000 2000

35、年年, ,已定已定名或暂定名的植物病毒的种类已达名或暂定名的植物病毒的种类已达909 909 种种, ,极难防治。如防治无方极难防治。如防治无方, ,不仅会影响作物的品质及产量不仅会影响作物的品质及产量, ,严重的只能拔除病株严重的只能拔除病株, ,造成很大经造成很大经济损失。病毒在植株上的分布是不均一的济损失。病毒在植株上的分布是不均一的, ,病毒是通过维管系统及病毒是通过维管系统及胞间连丝移动的胞间连丝移动的, ,老的组织和器官病毒含量高老的组织和器官病毒含量高, ,幼嫩未成熟的组织幼嫩未成熟的组织和器官病毒含量较低和器官病毒含量较低, ,如分裂速度很快的茎尖、根尖生长点几乎不如分裂速度很

36、快的茎尖、根尖生长点几乎不含病毒。用植物生长点培养法可获得无病毒植株含病毒。用植物生长点培养法可获得无病毒植株, ,恢复植物的优良恢复植物的优良品质品质, ,达到复壮的目的。达到复壮的目的。n目前已在广西荔蒲芋、永福罗汉果、桉树、马铃薯、甘薯、百合、目前已在广西荔蒲芋、永福罗汉果、桉树、马铃薯、甘薯、百合、兰花、大蒜、石竹、柑桔、草莓等植物品种上得到成功推广。兰花、大蒜、石竹、柑桔、草莓等植物品种上得到成功推广。3. 3. 新品种培育新品种培育n单倍体育种单倍体育种: :通过花药培养通过花药培养, ,从小孢子获得单倍体植株从小孢子获得单倍体植株, ,染色体染色体加倍后获得正常二倍体植株加倍后获

37、得正常二倍体植株, ,这是一条育种的新途径。单倍体育这是一条育种的新途径。单倍体育种可以缩短育种年限种可以缩短育种年限, ,节约人力物力节约人力物力, ,较快地获得优良品种较快地获得优良品种, ,目前目前已有已有4040多种多种植物获得了单倍体植株。我国在植物获得了单倍体植株。我国在水稻、小麦、烟草、水稻、小麦、烟草、柏树、橡胶、辣椒等植物柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上的单倍体育种的工作上, ,处于领先地位。处于领先地位。n胚培培养、子房培养、胚珠培养胚培培养、子房培养、胚珠培养: :为了克服植物远缘杂交的不亲为了克服植物远缘杂交的不亲和性和性, ,可采用胚、子房、胚珠培养和试管受

38、精等手段使胚正常发可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段使胚正常发育并成功地培养出杂交后代。现在已在棉花、玉米、黄麻等品育并成功地培养出杂交后代。现在已在棉花、玉米、黄麻等品种上获得成功。种上获得成功。4.4.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用在遗传、生理生化和病理等研究上的应用n要揭开生命活动的秘密，需要要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术多科学、多技术的相互配合，其的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。因为提供了一种有效、快

39、速的方法。因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调控等。分离单个基因，对它控等。分离单个基因，对它DNADNA进行测序，再对其中的某些碱基进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。通过组

40、织培养的方法才能实现。 5. 5. 种质资源的保存种质资源的保存n传统上传统上, ,种质是以种子的形式保存的。这种保存方法的种质是以种子的形式保存的。这种保存方法的局限性局限性: : (1)(1) 种子生活力随贮存时间的延长生活力逐渐下降种子生活力随贮存时间的延长生活力逐渐下降, ,并常受到病虫害的侵并常受到病虫害的侵袭袭; ; (2)(2) 难以保存无性繁殖的作物。另一方面难以保存无性繁殖的作物。另一方面, ,如用苗圃或田间大量如用苗圃或田间大量保存各种植物基因型保存各种植物基因型, ,成本极高成本极高, ,还存在天灾毁灭的危险。还存在天灾毁灭的危险。n在在低温条件下低温条件下(- 20 -

41、 - 196 )(- 20 - - 196 ) , ,在试管中保存组织培养物质的方在试管中保存组织培养物质的方法保存种质法保存种质, ,具有传统方法不可比拟的具有传统方法不可比拟的优点优点: : (1)(1) 只需要较少的空间只需要较少的空间就能保存大量的就能保存大量的“营养体种子营养体种子”( vegetative seeds) ; ( vegetative seeds) ; (2)(2) 不受不受病虫害侵染病虫害侵染; ; (3)(3) 当需要的时候当需要的时候, ,可把所贮存的材料用作核心原种迅可把所贮存的材料用作核心原种迅速繁殖出大量植株速繁殖出大量植株; ; (4)(4) 由于不带已

42、知的病毒和病原菌由于不带已知的病毒和病原菌, ,因此可以把因此可以把这些植物的克隆在国际间进行交换这些植物的克隆在国际间进行交换; ; (5)(5) 节省大量人力、财力、物力。节省大量人力、财力、物力。经低温贮藏的物种经低温贮藏的物种, ,保持了稳定的遗传性和良好的存活率。保持了稳定的遗传性和良好的存活率。据报导据报导, ,冷冷冻保存的胡萝卜胚状体冻保存的胡萝卜胚状体, ,在保存了在保存了1 1 年之后仍有再生成植株的能力。年之后仍有再生成植株的能力。6. 6. 产业化生产前景产业化生产前景n植物有用化合物包括植物有用化合物包括药物、蛋白质、脂肪、糖类、橡药物、蛋白质、脂肪、糖类、橡胶、香精油

43、、色素等胶、香精油、色素等。这些化合物许多都是高等植物。这些化合物许多都是高等植物的次生代谢物的次生代谢物, ,有些化合物还不能大规模地人工合成有些化合物还不能大规模地人工合成, ,而靠植物产生这些化合物产量有限。因此而靠植物产生这些化合物产量有限。因此, ,利用组织利用组织培养方法培养方法, ,培养植物的某些器官或愈伤组织培养植物的某些器官或愈伤组织, ,并筛选出并筛选出高产、高合成能力、生长快高产、高合成能力、生长快的细胞株系的细胞株系, ,以进行工业以进行工业化生产植物有用化合物化生产植物有用化合物, ,是一条行之有效的途径。是一条行之有效的途径。n近年来近年来, ,南京药学院丁家宜利用

44、组织培养生产出人参南京药学院丁家宜利用组织培养生产出人参干粉。这是我国干粉。这是我国第一个第一个用组织培养进行医药的工业化用组织培养进行医药的工业化生产的例子。生产的例子。 总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力也远段，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力也远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。的

45、经济效益。思考题思考题n1.1.愈伤组织的形态发生有哪两种情况愈伤组织的形态发生有哪两种情况? ?并比较并比较各自由此形成完整植株的不同。各自由此形成完整植株的不同。 n2.2.请以某种植物为例来论述其无菌苗的诱导、请以某种植物为例来论述其无菌苗的诱导、继代快繁、生根培养及其驯化移栽过程。继代快繁、生根培养及其驯化移栽过程。 n3.3.植物组织培养的主要意义有哪些？最新进植物组织培养的主要意义有哪些？最新进展如何？展如何？3.3.7 3.3.7 人工种子人工种子1.1.定义定义n人工种子（人工种子（artificial seed)artificial seed)是指通过植物组织培养是指通过植物

46、组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。n19781978年年，由著名的植物学家，由著名的植物学家MurashigeMurashige最早提出人工最早提出人工种子概念。种子概念。人工种子人工种子2. 人工种子的优点人工种子的优点（1 1）可根据不同植物的要求配制，如可加入植）可根据不同植物的要求配制，如可加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分等，物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分等，这样获得的人工种子就优越于天然种子，生这样获得的人工种子就优

47、越于天然种子，生产效率高；产效率高；（2 2）可以固定杂交优势，加速良种繁育；）可以固定杂交优势，加速良种繁育；（3 3）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；（4 4）可保存珍贵品种。）可保存珍贵品种。选取目标植物选取目标植物从适合的外植体诱导愈伤组织从适合的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基把愈伤组织转移到液体培养基愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移至无激素培养愈伤组织转移至无激素培养体细胞胚体细胞胚包裹人工种皮包裹人工种皮温室（大棚）播种温室（大棚）播种获取目标植物获取目标植物3. 3. 人工种子制作及培

48、养流程图示人工种子制作及培养流程图示4. 4. 人工种子制作的关键环节人工种子制作的关键环节 n（1 1）制备大量的高质量体细胞胚是人工种子）制备大量的高质量体细胞胚是人工种子制作的前提。制作的前提。n（2 2）体细胞胚胎发生的同步化控制。）体细胞胚胎发生的同步化控制。n（3 3）选择合理的包埋技术。）选择合理的包埋技术。 所谓高质量的体细胞胚，所谓高质量的体细胞胚，指的是体细胞胚指的是体细胞胚具有发育成完整小植株的能力，这就要求体细具有发育成完整小植株的能力，这就要求体细胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双极性结构，极性结构，这是人工种子制作能否成

49、功的关键这是人工种子制作能否成功的关键所在。所在。 人工种子的制作要求胚状体的人工种子的制作要求胚状体的形态上大小一致，形态上大小一致，发育进程上相似发育进程上相似，这样制成的人工种子其，这样制成的人工种子其活力强，活力强，萌发率高。萌发率高。 如何对体细胞胚胎发生进行同步化控制和纯化如何对体细胞胚胎发生进行同步化控制和纯化筛选呢？筛选呢？（1 1）化学抑制法化学抑制法（2 2）低温抑制法低温抑制法（3 3）渗透压选择法）渗透压选择法（4 4）机械过筛选择法）机械过筛选择法（5 5）应用植物胚性细胞分级仪）应用植物胚性细胞分级仪化学抑制法：化学抑制法：在细胞培养初期加入抑制在细胞培养初期加入抑

50、制DNADNA合成的合成的药物，使细胞药物，使细胞DNADNA合成暂时停止，当除去合成暂时停止，当除去DNADNA抑制抑制剂时，细胞开始进入同步分裂。剂时，细胞开始进入同步分裂。低温抑制法：低温抑制法：采用低温处理导致发育停滞，形成采用低温处理导致发育停滞，形成所谓的温度冲击，处理时间过后，恢复正常温度，所谓的温度冲击，处理时间过后，恢复正常温度，可以使胚性细胞达到同步分裂的目的。可以使胚性细胞达到同步分裂的目的。I. I. 人造种皮人造种皮 要求：要求：能保持胚状体的活力，利于萌发或贮藏。如海藻能保持胚状体的活力，利于萌发或贮藏。如海藻酸钠、明胶、树胶、琼脂糖、淀粉及动物胶等。酸钠、明胶、树

51、胶、琼脂糖、淀粉及动物胶等。II.II. 人造胚乳人造胚乳 人工胚乳的主要成分为人工胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质无机盐、碳水化合物及蛋白质等等营养物质。营养物质。III.III.包埋技术包埋技术v滴注法滴注法v装模法装模法滴注法滴注法5. 人工种子的研究现状及应用前景人工种子的研究现状及应用前景n美国加州的植物遗传公司率先申请了胡萝卜等多种植物的人工美国加州的植物遗传公司率先申请了胡萝卜等多种植物的人工种子的研究专利。种子的研究专利。n瑞士、法国的一些大公司集中研究开发蔬菜芽人工种子和胚芽瑞士、法国的一些大公司集中研究开发蔬菜芽人工种子和胚芽生产。生产。n欧洲多个国家联合攻关的尤

52、利卡计划中，把人工种子的研制作欧洲多个国家联合攻关的尤利卡计划中，把人工种子的研制作为生物技术研究的重点项目。为生物技术研究的重点项目。n我国在胡萝卜、芹菜、黄连、苜蓿等植物的人工种子的开发应我国在胡萝卜、芹菜、黄连、苜蓿等植物的人工种子的开发应用上也获得了阶段性成果。用上也获得了阶段性成果。 正因为人工种子在生产和科学研究中具有重要意正因为人工种子在生产和科学研究中具有重要意义，所以国内外都非常重视该领域的研究。义，所以国内外都非常重视该领域的研究。人工种子的产生是对植物传统繁殖方式的革命。人工种子的产生是对植物传统繁殖方式的革命。3.3.8 3.3.8 植物组织与器官的生物反应器培养植物组

53、织与器官的生物反应器培养 生物反应器技术生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代是植物组织或器官培养生产次生代谢产物走向工业化和产业化的关键技术。与适用于微生谢产物走向工业化和产业化的关键技术。与适用于微生物、植物细胞培养的生物反应器不同，物、植物细胞培养的生物反应器不同，适合植物组织或适合植物组织或器官培养的生物反应器系统具有其特殊性，如需考虑植器官培养的生物反应器系统具有其特殊性，如需考虑植物组织或器官的附着，以及有固定块状培养物带来的营物组织或器官的附着，以及有固定块状培养物带来的营养吸收、气体传递等问题。养吸收、气体传递等问题。利用高度分化的植物器官、利用高度分化的植物器官、组织培

54、养以提高目的产物含量的研究也日益引起人们的组织培养以提高目的产物含量的研究也日益引起人们的重视。根、芽、体细胞胚以及冠瘿组织等的培养研究都重视。根、芽、体细胞胚以及冠瘿组织等的培养研究都有一定发展。有一定发展。以以刘春朝刘春朝等人采用生物反应器培养青篙毛状根生产青篙等人采用生物反应器培养青篙毛状根生产青篙素为例来介绍生物反应器的植物组织与器官培养技术及素为例来介绍生物反应器的植物组织与器官培养技术及其应用。其应用。 青篙素青篙素为世界卫生组织为世界卫生组织(WHO)(WHO)推荐的治疗恶性疟疾推荐的治疗恶性疟疾( (如脑型疟疾和抗氯喹性疟疾如脑型疟疾和抗氯喹性疟疾) )的特效药，具有速效，低的

55、特效药，具有速效，低毒等特点。另外，毒等特点。另外，青篙素青篙素还有免疫促进作用和抗病毒作还有免疫促进作用和抗病毒作用，可开发抗病毒和抗艾滋病药物。世界上青篙素原料用，可开发抗病毒和抗艾滋病药物。世界上青篙素原料主要来源我国和越南，由于天然青篙素受气候，季节，主要来源我国和越南，由于天然青篙素受气候，季节，虫害等限制。每年青蒿素的产量远远不能满足市场需求，虫害等限制。每年青蒿素的产量远远不能满足市场需求，因此供不应求。因此供不应求。121151091414135231647一体化设计的一体化设计的雾化生物反应器雾化生物反应器（培养青篙毛状根生产青篙素培养青篙毛状根生产青篙素）1 生物反应器生物

56、反应器2 中心筒中心筒3 不锈钢筛网不锈钢筛网4 空气出口空气出口5 时间继电器时间继电器6 雾化头雾化头7 培养液培养液8 空气入口空气入口9 空气过滤器空气过滤器10 流量计流量计11 电磁阀电磁阀12 空气储罐空气储罐13 雾化装置雾化装置14 40w日光灯日光灯8雾化反应器雾化反应器3.3.10 3.3.10 植物组织与器官培养存在的问题植物组织与器官培养存在的问题1.1. 研究中的问题研究中的问题 对于植物全能性表达和激素作用机制等尚未开展深入研究，而对于植物全能性表达和激素作用机制等尚未开展深入研究，而且对于培养比较困难的植物缺乏研究。且对于培养比较困难的植物缺乏研究。2.2. 技

57、术上的问题技术上的问题 效率偏低、操作比较繁琐、培养结果比较难以确定等技术问题效率偏低、操作比较繁琐、培养结果比较难以确定等技术问题还需解决。还需解决。3.3. 可应用性范围可应用性范围 目前有许多植物还未培养成功，许多有意义的杂交亲本或组合目前有许多植物还未培养成功，许多有意义的杂交亲本或组合还不能培养成功，或不能有效培养成功。还不能培养成功，或不能有效培养成功。4.4. 生物反应器技术生物反应器技术 （1 1）适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制。）适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制。 （2 2）提高生物反应器技术内部培养物生长的均匀性和空间利用率。）提高生物反应器技术内部培养物

58、生长的均匀性和空间利用率。 （3 3）培养物接种、取样、无菌化等操作技术的优化。）培养物接种、取样、无菌化等操作技术的优化。 （4 4）不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制。）不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制。 （5 5）生物反应器培养的放大技术。）生物反应器培养的放大技术。3.4 3.4 植物细胞培养植物细胞培养3.4.1 3.4.1 定义定义3.4.2 3.4.2 植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法3.4.3 3.4.3 植物细胞培养的培养基植物细胞培养的培养基3.4.4 3.4.4 植物单细胞培养植物单细胞培养3.4.5 3.4.5 植物细胞培养的意

59、义植物细胞培养的意义3.4.6 3.4.6 植物细胞的生物反应器大规模培养植物细胞的生物反应器大规模培养（自学）（自学）3.4.7 3.4.7 植物细胞两相培养技术植物细胞两相培养技术（自学）（自学）3.4.8 3.4.8 植物细胞的生物反应器固定化培养植物细胞的生物反应器固定化培养（自学）（自学）3.4.9 3.4.9 植物细胞培养存在的问题与发展趋势植物细胞培养存在的问题与发展趋势3.4.1 3.4.1 定义定义 植物细胞培养植物细胞培养（plant cell culture)plant cell culture)是指在离体条是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养集件下

60、，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养集中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。术。 植物细胞培养的理论基础植物细胞培养的理论基础是植物细胞的单个细胞内是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部能力（全能性）。存在生命体的全部能力（全能性）。3.4.2 3.4.2 植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法 根据根据培养对象培养对象，植物细胞培养主要有，植物细胞培养主要有单细胞培单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养等。养、单倍体培养、原生质体培养