DNA的结构(下)

1、“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“light” DNA “Hybrid” DNA（1958 Meselson 和Stahl ）： DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。1、四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)2、以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA3、DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、此酶以DNA为模板合成一段RNA ，这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 5、 以DNA为模板的DNA合成酶 以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 反应需要有模板的指导 反应需要有

2、3-OH存在 DNA链的合成方向为5 3 性质 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性+ + + +5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生链合成-+主要是对主要是对DNADNA损伤损伤的修复；以及在的修复；以及在DNADNA复制时切除复制时切除RNARNA引物并填补其引物并填补其留下的空隙。留下的空隙。修复紫外修复紫外光引起的光引起的DNADNA损伤损伤DNA DNA 复制的主复制的主要聚合酶，还要聚合酶，还具有具有3 3-5-5外切酶的校对外切酶的校对功能，提高功能，提高DNADNA复制的保复制的保真性真性 定位定位 细胞核细胞核 细胞核细胞核 线粒体线粒体 细胞核细胞核

3、 细胞核细胞核3-53-5外切外切 - - + + +- - + + +酶活性酶活性功能功能引物引物合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制复制复制修复修复真核生物中的DNA聚合酶 真核细胞主要有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶（定位于胞核，参与复制引发具53外切酶活性），（定位于核内，参与修复，具53外切酶活性），（定位于线粒体，参与线粒体复制具53和35外切活性），（定位于核内，参与复制，具有35和53外切活性），（定位于核内，参与损伤修复，具有35和53外切活性）。 6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是

4、3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起重复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用要作用3535OHOHP P 使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。r

5、eprep蛋白沿蛋白沿3 3 5 5移动，而解螺旋酶移动，而解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿沿5 5 3 3移动。移动。9、稳定已被解开的稳定已被解开的DNADNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。降解。 双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 复制的终止lDNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段。l复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。 基本概念： 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子 复制时，解链酶等先将DNA的一

6、段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉复制叉复制叉复制叉复制叉复制方向和速度： 单单起点、起点、双双向等速向等速多多起点、起点、双双向等速向等速Electron Microscopy of replicating DNA revealsreplicating bubbles. How does one provebidirectional fork movement?DNA的复制Pulse with radiolabeled nucleotide; chase with coldnucleotide. Then do autoradiography双链解开、复制起始大

7、约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合在HU蛋白和ATP的共同作用下,DNA复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链2 2、RNARNA引物的合成引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸， DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。 在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DN

8、A链为滞后链。 在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段冈崎片段。 （复制终止）在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链 a、终止序列终止序列 E.coli E.coli 有两个终止区域，分别结合专一有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白性的终止蛋白 序列一：序列一：terE terD terAterE terD terA 序列二：序列二：terF terB terCterF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用每个区

9、域只对一个方向的复制叉起作用 b b、专一性终止蛋白、专一性终止蛋白 E.coli E.coli 中由中由 tus gene tus gene 编码编码 通过抑制通过抑制DNADNA螺旋酶而发挥终止作用螺旋酶而发挥终止作用ter双链环状、型复制、双向等速线性DNA双链的复制滚环型：单向复制的特殊方式如：174的双链环状DNA复制型（RF）T7 DNA的复制痘病病毒DNA的复制 (1 (1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体：噬菌体：滚环产生多聚复制子）；滚环产生多聚复制子）；(2(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性）某种

10、蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与病毒核酸具有与55端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒楚的例子是腺病毒 DNA )DNA )。(3(3）DNADNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。草履虫（游离末端。草履虫（ParameciumParamecium）的线性线粒体）的线性线粒体DNADNA的复的复制中就形成了一种交联；制中就形成了一种交联；(4(4）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能

11、采用这种方式，在这种情况下，采用这种方式，在这种情况下，DNADNA末端的短重复序列的末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）拷贝数改变（如端粒的复制）?二聚体二聚体3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT T7 7噬噬菌菌体体的的末末端端复复制制专一性核专一性核酸内切酶酸内切酶 线性DNA 双链的复制单一起点、单向，如：腺病毒 腺病毒腺病毒 DNA 复制起始复制起始GIRIR长的发长的发夹结构夹结构复制起始复不需引物复制起始复不需引物,避免避免5-end shortent 不需RNA引物，在正链3OH上延伸;只有一个复制叉滚环复制D D环复制环复制单向复制的特殊方式如：动物线粒

12、体DNA（五）真核生物中DNA的复制特点真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。复制元相对较小(40-100kb), 复制速度较慢,大 约5005000bp/min.真核生物有多种DNA聚合酶。组蛋白八聚体是以全保守的方式传给子代分子的真核生物复制起始区 酵母的复制起点称为:自主复制顺序(autonomously replicating sequence,ARS) ARS序列的共同特征：具有一个称为A区的11个A-

13、T碱基对的保守序列。 起始需要起始点识别复合物ORC参与，ORC结合于ARS，它是由6种蛋白质组成的复合物。 真核生物染色体真核生物染色体 DNA末端补齐模式末端补齐模式 (1) 端粒端粒DNA (Telomer)(Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (富含富含 G 链链) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (富含富含 C 链链) （2） 端粒酶（端粒酶（ Telomerase）1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchl

14、ing Gottchling 四膜虫四膜虫 端粒酶端粒酶 （ telomerase ）将）将T2G4 末端重复延伸末端重复延伸 游扑虫游扑虫 TelomeraseTelomerase = RNA CAAAACCCC 链链 + 末端结合蛋白末端结合蛋白 （TBP） 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶a、核蛋白（、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含约长、含约长150NT的的RNA，其中含，其中含 15 拷贝的拷贝的CxAy重复序列，重复序列， 是合成端粒是合成端粒T2G4的模板的模板c、延长的、延长的3-T2G4端（端（一段一段cDNA）作为）作为5-端端DNA合成的模板合成的

15、模板（3） 补齐过程补齐过程 通过通过TG链的回折形成链的回折形成 发夹结构（发夹结构（GG氢键）氢键） 尺蠖模型尺蠖模型 实现端粒酶位置的实现端粒酶位置的 调整调整 G G hoogsteen 氢键氢键 三螺旋三螺旋DNA G链链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C链链-A2C4- G链链 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC链链-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorG链链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTG

16、GGGTTGGGGTTGGGG C链链-A2C4- 大肠杆菌染色体DNA的复制调控 ColE1质粒DNA的复制调控 真核细胞DNA的复制调控:细胞生活水平调控染色体水平调控复制子水平调控 作业：作业：1、请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的。（中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士研究生分子遗传学入学考试，8分）2、名词解释 ：冈崎片段，（华中科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题，3分） Replicon， semi-conservative replication （武汉大学2003年硕士研究生入学分子生物学试题）3、原核DNA合成酶中（ ）的主要功能

17、是合成前导链和冈崎片段A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、引物酶 （华中科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题） 对于生命状态存在和延续来说，DNA分子要求保持高度的精确性和完整性，细胞中没有哪一种分子可以和它相比。在长期进化中，生物体不仅演化出能纠正偶然的复制错误的系统，而且还存在着能修复环境因素（如射线）和体内化学物质造成的DNA分子的损伤的系统。 碱基的脱落 AP位点 碱基（或核苷）的改变 错误碱基 碱基的缺失或插入 嘧碇碱基的二聚化 链的断裂 DNA链的交联 氧自由基对DNA的损伤错配修复恢复错配碱基切除修复切除突变的碱基核苷酸切除修复修复被破坏

18、的DNADNA直接修复修复嘧啶二聚体或甲基化DNA易错修复应急措施 Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺酸甲基化 甲基化紧随在DNA复制之后进行 根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基发现错配碱基在水解ATP的作用下，MutS， MutL与碱基错配点的DNA双链结合MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链 错配碱基位于切口3下游端，错配碱基位于切口5上游端， 一些碱基在自发或诱变下会发生脱氨基，然后改变配对性质，造成氨基转换突变 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对糖

19、苷水解酶识别改变了的碱基，把碱基从糖苷水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-N- -糖苷键糖苷键处切下来，在处切下来，在DNADNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为称为APAP位点位点。由AP核酸内切酶将受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开。DNA连接酶连接利用DNA聚合酶I切除损伤部位，补上核苷酸3、核苷酸切除修复1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链4）DNA连接酶将切口补平识别损伤部位损伤的两边切除几个核苷酸DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链DNA连接酶将切口补平4 、DNA

20、的直接修复在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体甲基转移酶甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对光复活：光敏裂合酶在可见光300nm-600nm下活化而催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体。5、SOS修复修复 SOS修复的概念：SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，但留下的错误较多。 RecA蛋白的主要生化活性重组活性单链DNA结合活性蛋白酶活性 RecA蛋白的作用水解LexA蛋白 LexA蛋白的作用是一种阻遏蛋白,结合于SOS系统中各基因的操纵子上,使得

21、这些基因不能产生转录产物 对自身基因的表达也有负向控制作用,但正常细胞中其表达量足以阻遏所有SOS基因的表达 当细胞DNA复制受阻时，LexA蛋白被RecA蛋白触发，发生自身催化的水解作用，SOS系统被激活，lexA基因表达也增加。 DNA复制正常后,RecA蛋白失活,LexA蛋白恢复对SOS系统的阻遏作用 由LexA控制的SOS基因构成一个调控元 LexA控制17个基因,统称din(damage inducible genes)基因,或SOS基因 SOS框：所有SOS基因的操作子都含有20bp的LexA结合位点,称为SOS框(SOS box)作业：作业： 扼要说明细胞中DNA修复系统有哪几种

22、（8分）（中国科学院2002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题）（一）转座成分的发现：50年代初，McClintock通过对玉米遗传现象的精细研究，首先发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分（Controlling elements）。 基因组上不必借助于同源序列就可移动的DNA片段称为转座子（transposons）或转座元件。转座子的转移过程称为转座。 转座作用涉及到转座子的复制，当一个拷贝插入基因组的新位置，原来位置上仍可保留一个拷贝。因此转座作用并不是转座子由基因组的一处转移到另一处的简单过程。 转座频率和自发突变的频率相似，介于每世代每细胞10-5-10-7之间，转座子的切除频率要

23、低得多，介于每世代每细胞10-6-10-10之间。 细菌中的转座成分依组成结构可以分为以下几类：插入序列（insertion sequences)，复合转座子（composite transposons），TnA转座子家族（ TnA family）和可转移噬菌体（transposable phages）。 转座子的结构特征：转座子具有反向末端重复序列以及具有编码转座酶的基因。插入序列（因其插入使靶点处基因失活而被发现） IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。 IS的命名、分布及结构命名：以IS开头，后加不同数字。分布：是细菌染色体、质粒和某些噬菌

24、体的正常组分。 ：IS1 表示IS1因子插入在噬菌体基因组内。 复合转座子 复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。TnA家族复制转座是TnA家族中迁移的唯一模式，它由巨大的(5kb)转座子构成。它们不是复合依靠IS类型的转座组件，但是构成独立系统携带基因进行转座作用。TnA家族具有38bp的反向重复末端。一个5bp的同向重复序列在一个靶位点被产生。它们携带抗性标记，如ampr。TnA的转座作用的两个过程被转座酶和解离酶完成，其编码基因为tnpA和tnpR。解离酶需要一个确切的内部位点，是TnA家族的的特色。 转座酶的含量是转座作

25、用的限制因子。 Ac-Ds系统（激活-解离系统） 非复制型转座 自主性因子，非自主性因子Ac和Ds位于玉米的第九号染色体短臂，在色素基因C的附近。 Ac因子全长4.5kb，有5个外显子，其产物是转座酶。Ac因子两端是长11bp的反向重复序列(IR)； Ds因子长0.4-4kb，它的中间(在转座酶基因中)有许多种长度不等的缺失, 如Ds9缺失194bp，Ds6缺失2.5kb，Ds的两端也都有11bp的反向重复序列。Ds是Ac转座子的缺失突变体，Ac编码转座酶，能自主转座，Ds不能自主转座，但有Ac存在时，能活化Ds使其转座。逆转录转座子 Copia因子是果蝇的一种反转录转座子(retrotran

26、sposon或retroposon)，所谓反转录转座子是指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。 Copia因子全长5000bp左右，两端各有-个相同的276bP的正向重复序列(DR)，每个正向重复序列本身的两端还各有一个反向重复序列(IR)。当Copia因子转座插入染色体时，在插入位点上产生5bp的正向重复序列。 P转座子 非复制型转座子 杂种不育 果蝇的P转座子有两种类型，一类是全长P转座子，长2907bp，两端有33bp的反向重复序列(IR)，有4个外显子(4个ORF)，编码转座酶；另一类为缺失型P因子，它不能编码转座酶，它的转座依赖于全长P转座子。缺失型P转座子都是由活性P因子的中段缺失衍生而来的，长度从500bp到1400bp不等。 不带有P转座子的品系称为M品系，带有P转座子的品系称为P品系。 果蝇杂种不育仅发生在P X M中 果蝇杂种不育取决于基因组中P因子和不同细胞型中阻遏蛋白的相互作用 主要过程 1、在靶DNA上制造一个交错的切口 2、转座子与突出的单链末端相连接 3、填充缺口（1）末端倒转重复序列（inverted terminal repeats）（2）靶点倍生序列 二、两种不同类型的转座（一）复制型转座（replicative transpo